本文關鍵詞：MiR-149調(diào)控轉錄因子F0XM1抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲的研究　出處：《南方醫(yī)科大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景：在全世界范圍內(nèi),結直腸癌(colorectal cancer,CRC)的病死率居所有惡性腫瘤的第三位,總發(fā)病率約占5%,5年生存率約為40%-60%。盡管CRC的治療在過去數(shù)十年中取得了長足進步,但患者總生存期并未明顯延長。超過1/3的CRC最終將發(fā)生遠處轉移,這將導致患者的不良預后和低生存率。由于CRC侵襲轉移的分子機制復雜,因此,參與此過程新分子的發(fā)現(xiàn)對于CRC的靶向治療將至關重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長約17到25個核苷酸的非編碼小RNA分子(non-coding RNA,ncRNA),通過與靶信使核糖核酸(mRNA)3’端非編碼區(qū)(3'-UTR)特異結合,抑制轉錄后翻譯而下調(diào)基因表達。MiRNA的調(diào)節(jié)異常在人體許多生理生化過程中起著決定性的作用,如細胞增殖、分化、細胞凋亡、惡變和轉移等。近來研究發(fā)現(xiàn),miR-149在多種惡性腫瘤中呈低表達,并在非小細胞肺癌、惡性膠質(zhì)瘤、胃癌中起著抑癌基因的作用。目前miR-149和CRC的相關性已被多個研究報道：Wang等發(fā)現(xiàn),在CRC中SP1可調(diào)節(jié)抑癌基因miR-149甲基化和表達之間的聯(lián)系；Vinci等探討了miR-146a、miR-196a、miR-499和miR-149在CRC中序列變化的分布規(guī)律及對miRNA表達的影響；Du等發(fā)現(xiàn),miR-149和miR-196a2的多態(tài)性可能提高CRC的發(fā)病風險。這些研究均表明,miR-149的調(diào)節(jié)異常將對CRC的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。叉頭框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)屬于叉頭框蛋白家族,是一個典型的增殖特異性轉錄因子。該家族成員均具有一個高度保守脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)結合域,稱為“叉頭框”或“翼狀螺旋結構”。FOXM1在調(diào)節(jié)有絲分裂Gl-S、G2-M和紡錘體穩(wěn)定中起著重要作用,其高表達可能導致細胞惡變和腫瘤進展。在多種惡性腫瘤中,均發(fā)現(xiàn)FOXM1及其家族其他成員的高表達狀態(tài),并且FOXM1的高表達狀態(tài)與腫瘤的血管生成、侵襲和轉移過程密切相關。在既往研究中,我們已證實FOXM1高表達可作為CRC侵襲轉移潛能和不良預后的預測分子指標,然而其相關的分子機制尚未明確。目前有研究發(fā)現(xiàn),miR-149可通過調(diào)控FOXM1表達抑制非小細胞肺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transitiong, EMT),但其在CRC細胞侵襲轉移中的作用尚未明確。本研究利用實時定量RT-PCR、Western blot、生物信息學和熒光素酶活性實驗等方法,分析miR-149在CRC組織和細胞中的表達水平及其臨床病理和預后價值,探尋miR-149對CRC細胞中FOXM1基因表達的調(diào)控作用,并通過體外實驗探索其在CRC細胞遷移和侵襲過程中的功能和分子機制。目的：探討miR-149表達在CRC中的臨床病理意義和預后價值,以及miR-149/FOXM1在CRC細胞遷移和侵襲過程中的功能和機制,為進一步闡明和完善CRC中miR-149表達紊亂及其功能異常的分子調(diào)控機制,尋找CRC新的治療靶點提供實驗依據(jù)。方法和結果：第一章MiR-149在CRC中的表達及其臨床意義方法：1.在收集的CRC組織、癌旁組織、正常結腸組織、一系列轉移能力不同的CRC細胞(HCT116、LoVo、SW480)和正常結腸細胞(NCM460)中,利用實時定量RT-PCR檢測miR-149的表達水平。2.結合臨床信息分析全部78例CRC組織中miR-149表達水平與臨床病理特征和預后的關系。3.在收集的CRC組織、癌旁組織和正常結腸組織中,運用實時定量RT-PCR檢測FOXM1的表達水平,并分析其與miR-149表達水平之間的關系。結果：1.CRC組織(n=78)中miR-149的表達水平顯著低于正常結腸組織(n=20)(P0.01)；與對應癌旁組織(n=20)相比,CRC組織(n=20)中miR-149的表達水平顯著降低(P0.01)；同時,與無淋巴結或遠處轉移的CRC組織(nmCRC,n=38)相比,有轉移的CRC組織中(mCRC,n=40) miR-149表達水平顯著降低(P0.01)。此外,正常結腸細胞株NCM460的miR-149表達水平最高,低轉移性CRC細胞株LoVo和SW480次之,高轉移性CRC細胞株HCT116中,miR-149表達水平最低(P0.01)。2.相關性分析發(fā)現(xiàn),CRC組織中miR-149的表達水平與患者淋巴結轉移(P=0.024)、遠處轉移(P=0.045)、TNM分期(P=0.033)呈顯著相關；Kaplan-Meier生存曲線和Cox風險比例回歸模型分析發(fā)現(xiàn),miR-149低表達預示總生存期縮短(P0.01),可作為判斷CRC患者預后的獨立危險因素(P=0.011; HR=2.658; 95% CI:1.308-3.087)。3.CRC組織(n=78)中FOXM1的mRNA表達水平顯著高于正常結腸組織(n=20)(P0.01)；20對CRC和癌旁組織對比中,癌組織中FOXM1 mRNA表達水平顯著增高(P0.01)；同時,有淋巴結或遠處轉移的CRC組織(mCRC,n=40)中FOXM1 mRNA表達水平顯著高于無轉移的CRC組織(nmCRC,n=38)(P0.01)。此外,FOXM1的表達水平和miR-149表達水平呈負相關(r=-0.553,P0.01)。第二章MiR-149對CRC細胞和正常結腸細胞生物學特性的影響方法：1.通過合成miR-149 mimics和inhibitor并瞬時轉染CRC細胞(HCT116、LoVo)和正常結腸細胞(NCM460),人為改變細胞內(nèi)miR-149表達水平,運用MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗分別檢測細胞增殖、遷移和侵襲能力的變化。結果：1.與對照組miR-NC mimics相比,轉染miR-149 mimics的HCT116細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降(P0.01)。相反,在LoVo細胞中人為下調(diào)miR-149表達水平,可增強細胞的增殖、遷移和侵襲能力(P0.05)。2.下調(diào)正常結腸細胞NCM460中miR-149表達水平,可增強細胞的遷移和侵襲能力(P0.05)。第三章MiR-149靶向調(diào)控CRC細胞FOXM1基因的表達方法：1.運用三個不同的miRNA/靶基因在線分析軟件TargetScan (http://www.targetscan.org/)、PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/)和miRNA targets (http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/),分析FOXM1 mRNA 3'-UTR序列中潛在的miRNA結合位點,將預測結果作交集分析。2.將miR-149 mimics、inhibitor及其對照分別與含F(xiàn)OXM1-3'-UTR-wt和FOXM1-3'-UTR-mut序列的熒光素酶質(zhì)粒載體瞬時共轉染HCT116細胞,運用熒光素酶活性實驗,根據(jù)熒光素酶活性變化鑒定miR-149是否能與FOXM13'-UTR序列結合。3.運用實時定量RT-PCR和Western blot驗證miR-149對FOXM1的調(diào)控作用。結果：1.通過生物信息學軟件和交集分析發(fā)現(xiàn),FOXM1 mRNA 3'-UTR序列上存在miR-149的潛在結合位點。2.熒光素酶活性實驗發(fā)現(xiàn),miR-149能與FOXM1 mRNA3'-UTR序列結合,使熒光強度顯著下降。3.MiR-149能直接靶向調(diào)控FOXM1基因的表達。第四章MiR-149調(diào)控CRC細胞侵襲轉移的機制研究方法：1.構建FOXM1干擾質(zhì)粒(pSil/shFOXM1)并穩(wěn)定轉染HCT116和LoVo細胞,人為下調(diào)細胞內(nèi)FOXM1的表達水平,采用MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗檢測各組細胞增殖、遷移和侵襲能力的差異。2.構建FOXM1基因真核表達載體(pEGFP/FOXM1)與空質(zhì)粒對照(pEGFP/control)分別轉染HCT116/miR-149 mimics細胞,實時定量RT-PCR和western blot技術檢鋇FOXM1 mRNA和蛋白表達水平的變化。MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗分析各組細胞增殖、遷移和侵襲能力的差異。3.運用實時定量RT-PCR和Western blot技術分別檢測HCT116/miR-149 mimics、 HCT116/shFOXMl及其對照細胞中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表達水平。FOXM1基因真核表達載體(pEGFP/FOXM1)與空質(zhì)粒對照(pEGFP/control)分別轉染HCT116/miR-149 mimics細胞,實時定量RT-PCR和Western blot技術檢測MMP-2、MMP-9、VEGF-A和PAR mRNA和蛋白的表達水平。4.實時定量RT-PCR檢測miR-149高表達組(n=33)和miR-149低表達組(n=-45)CRC組織中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表達水平。結果：1.HCT116/shFOXM1和LoVo/shFOXM1細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降。提示阻斷FOXM1的表達可模擬miR-149對CRC細胞的生物學效應。2. FOXM1表達恢復可部分逆轉miR-149過表達所介導的對CRC細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示miR-149對CRC細胞生物學特性的作用部分是由FOXM1介導的,FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因。3.上調(diào)miR-149或下調(diào)FOXM1均能抑制CRC細胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的表達。恢復FOXM1表達能逆轉miR-149過表達對CRC細胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR表達的抑制作用。4.MiR-149低表達組(n=45)CRC組織中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表達水平均高于miR-149高表達組(n=33)。結論和意義：1.MiR-149在CRC組織尤其是有淋巴結或遠處轉移的組織中低表達,FOXM1在CRC組織中高表達,兩者呈負相關。MiR-149的表達水平與CRC患者淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期以及臨床預后相關。2.MiR-149可抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。3.MiR-149能與FOXM1 mRNA 3'-UTR直接結合并調(diào)控FOXM1基因的表達。4.MiR-149對CRC細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用部分是由FOXM1介導的,并與MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR密切相關。提示FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因,MMP-2、MMP-9. VEGF-A和uPAR可能是miR-149/FOXM1影響CRC細胞遷移和侵襲的重要效應分子。5.本研究首次分析了miR-149在CRC中的表達異常及其與臨床病理特征和預后的關系,發(fā)現(xiàn)了miR-149對CRC細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響,并探討了miR-149在CRC細胞中發(fā)揮作用的分子機制。提示miR-149/FOXM1通路可能成為CRC治療的新型分子靶點。
[Abstract]:It is found that miR - 149 and miR - 196a2 polymorphism may play an important role in the development of CRC . It has been found that miR - 149 and miR - 196a2 polymorphism may play an important role in the development of CRC . In recent studies , it has been found that miR - 149 and miR - 196a2 can play an important role in the development of CRC . The expression level of miR - 149 in CRC was determined by real - time quantitative RT - PCR ( RT - PCR ) , Western blot , bioinformatics and luciferase activity assay . Compared with normal colon tissue ( P = 0 . 011 , HR = 2.658 ; 95 % CI : 1.308 - 3.087 ) , the expression level of FoxM1 mRNA was significantly higher in CRC ( n = 78 ) than that in normal colon ( P = 0 . 011 ; HR = 2.658 ; 95 % CI : 1.308 - 3.087 ) . The expression level of miR - 149 in normal colon cell NCM460 was regulated by using three different miRNA / target gene on - line analysis software TargetScan ( http://www.targetscan .org/). The expression levels of MMP - 2 , MMP - 9 , VEGF - A and uPAR mRNA and protein were detected by RT - PCR and Western blot . Results : 1 . The expression levels of MMP - 2 , MMP - 9 , VEGF - A and PAR mRNA and protein were detected by real - time quantitative RT - PCR and Western blot . MiR - 149 inhibited the expression of MMP - 2 , MMP - 9 , VEGF - A and uPAR in CRC cells . Conclusion : MiR - 149 can reverse the expression of MMP - 2 , MMP - 9 , VEGF - A and uPAR in CRC cells . VEGF - A and uPAR may be the important effector molecules that affect the migration and invasion of CRC cells . 5 . This study first analyzes the expression of miR - 149 in CRC and its relationship with clinicopathological features and prognosis . It has been found that miR - 149 plays a role in the proliferation , migration and invasion of CRC cells , and discusses the molecular mechanism of miR - 149 in CRC cells . It is suggested that miR - 149 / FoxM1 pathway may be a new molecular target for CRC treatment .

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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1 戴穎青;王安明;劉琦;;Wnt信號通路異常激活在卵巢上皮性癌中的作用[J];醫(yī)學研究生學報;2012年03期

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本文編號：1428547