發(fā)布時間：2017-12-29 19:14

  本文關(guān)鍵詞：CGI-58對5-FU誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞凋亡的影響及機制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞(腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAM)的存活有利于腫瘤的惡性發(fā)展[3,4,5,52],而化療能附帶殺死TAM起輔助療效。研究TAM對化療的敏感性,對于探索腫瘤的化療抵抗機制具有重要意義。5-FU是黑色素瘤、結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤等惡性實體腫瘤的常用化療藥物[1,2],但它對TAM的殺傷作用尚不明確。在前期實驗中,我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌TAM中脂質(zhì)分解代謝顯著增強,提示TAM的存活和功能活性依賴于旺盛的能量代謝[54],干預(yù)TAM的物質(zhì)能量代謝,可能會影響5-FU對TAM的殺傷敏感性[54],使5-FU等化療對TAM的殺傷作用更明顯。在前期實驗中我們又發(fā)現(xiàn):巨噬細胞中的CGI-58能夠促進脂肪分解和線粒體的耗氧,抑制活性氧ROS的生成,提示CGI-58可能會影響5-FU對巨噬細胞的殺傷作用[54]。前期研究表明:脂肪分解代謝的關(guān)鍵基因CGI-58在結(jié)腸癌TAM中顯著升高[6];而CGI-58又是是調(diào)節(jié)線粒體功能的重要因子[7],提示TAM可能抵抗5-FU的殺傷作用,進而導(dǎo)致化療效果不佳。我們首先在體外用CCK-8法檢測了5-FU處理普通巨噬細胞(PLKO)與CGI-58特異性敲低的巨噬細胞(CGI-58-KD)的細胞增殖能力,通過流式細胞術(shù)檢測5-FU誘導(dǎo)的PLKO與CGI-58-KD的細胞周期與凋亡,Western Blot檢測其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表達水平,Seahorse Assays檢測其線粒體功能并用活性氧阻斷劑NAC進行了回復(fù)實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGI-58缺失會促進5-FU對巨噬細胞增殖活力的抑制作用,主要是通過促進5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡而對其周期阻滯無顯著影響,并且會損傷巨噬細胞的線粒體功能,導(dǎo)致ROS聚集,而清除ROS后CGI-58缺失促進5-FU對巨噬細胞殺傷活性的效應(yīng)消失�；谏鲜鲶w外研究的發(fā)現(xiàn)我們進一步在體內(nèi)進行了驗證。我們在體內(nèi)用成功構(gòu)建的CGI-58過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠黑色素瘤移植瘤模型檢測了5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腫瘤生長和預(yù)后的影響,并分別用巨噬細胞去除劑和活性氧ROS抑制劑NAC干預(yù)后檢測了5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腫瘤生長和預(yù)后的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAM可以抵抗5-FU的化療效果,使預(yù)后變差,并且巨噬細胞CGI-58過表達會抵抗5-FU對腫瘤的殺傷作用,而清除ROS后CGI-58過表達抵抗5-FU殺傷腫瘤的效應(yīng)增強。以上結(jié)果表明CGI-58缺失可促進5-FU對巨噬細胞的殺傷作用,而CGI-58過表達可抑制5-FU對巨噬細胞的殺傷作用;CGI-58對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞殺傷敏感性的影響,主要是通過影響凋亡而非周期阻滯;CGI-58影響5-FU對巨噬細胞的殺傷作用是通過影響巨噬細胞ROS的產(chǎn)生來實現(xiàn)的;CGI-58通過影響TAM中的線粒體功能,抑制ROS生成,促進黑色素瘤TAM對5-FU的抵抗作用,進而減弱5-FU對腫瘤的化療效果,導(dǎo)致腫瘤惡性進展,預(yù)后不佳。因此,以CGI-58為切入點從TAM脂質(zhì)分解代謝的角度來闡明CGI-58對5-FU誘導(dǎo)的TAM凋亡的影響及其作用機制,研究結(jié)果對于探索提高5-FU等化療藥物對腫瘤的療效有重要的指導(dǎo)意義。目的:研究CGI-58對5-FU誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細胞凋亡的影響及其作用機制。方法:一、離體實驗考察CGI-58抵抗5-FU對巨噬細胞的殺傷作用及機制1.CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖能力的影響為了研究CGI-58抵抗5-FU對巨噬細胞的殺傷作用,我們在體外用CCK-8法檢測了5-FU處理PLKO與CGI-58-KD的細胞增殖活力。2.CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞周期的影響為了研究CGI-58抵抗5-FU對巨噬細胞的殺傷作用機制,我們首先在體外通過流式細胞術(shù)檢測了5-FU處理的PLKO與CGI-58-KD的細胞周期,觀察不同處理條件下G1期的細胞比例。3.CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡的影響為了研究CGI-58缺失5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡的影響,我們在體外通過流式細胞術(shù)檢測了5-FU處理的PLKO與CGI-58-KD的細胞凋亡,并用Western Blot檢測了其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表達水平。4.CGI-58缺失對巨噬細胞線粒體功能的影響為了進一步研究CGI-58抵抗5-FU對巨噬細胞的殺傷作用機制,我們又在體外對PLKO與CGI-58-KD的線粒體功能進行了檢測,通過Seahorse檢測了其基礎(chǔ)耗氧率OCR,生物發(fā)光法檢測了其ATP生成量,熒光法檢測了其活性氧ROS的生成情況。5.清除ROS后CGI-58缺失對巨噬細胞線粒體功能及5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖和凋亡的影響為了驗證上述效應(yīng)機制我們用活性氧抑制劑NAC做了回復(fù)實驗,NAC阻斷處理后在體外通過熒光法檢測了PLKO與CGI-58-KD的ROS的生成情況,CCK-8法檢測了5-FU處理的PLKO與CGI-58-KD的細胞增殖能力及Western Blot檢測了其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表達水平。二、在體實驗考察腫瘤相關(guān)巨噬細胞CGI-58對5-FU化療效果的抵抗作用1.CGI-58轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(TG~(CGI-58))我們用Western Blot鑒定了CGI-58過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腹腔原代巨噬細胞及其他組織器官的CGI-58的表達水平。2.移植瘤(黑色素瘤)型中,去除巨噬細胞后5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腫瘤預(yù)后的影響在體內(nèi)給轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)皮下接種黑色素瘤后給予5-FU和巨噬細胞去除劑(氯膦酸二鈉脂質(zhì)體)處理,動態(tài)檢測小鼠的體重和生存期。3.移植瘤(黑色素瘤)模型中,5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腫瘤生長和預(yù)后的影響在體內(nèi)給轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)皮下接種黑色素瘤后給予5-FU化療,動態(tài)檢測小鼠的體重、腫瘤生長情況及生存期。4.移植瘤(黑色素瘤)模型中,清除ROS后5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)的腫瘤生長和預(yù)后的影響用活性氧抑制劑NAC阻斷處理后在體內(nèi)通過皮下移植瘤(黑色素瘤)實驗動態(tài)檢測5-FU化療后轉(zhuǎn)基因(TG~(CGI-58))小鼠和野生型(WT)小鼠的體重、腫瘤生長情況及生存期。結(jié)果:(一)離體實驗考察CGI-58抵抗5-FU對巨噬細胞的殺傷作用及機制1.CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖能力的影響5-FU處理后,CGI-58-KD比PLKO細胞的增殖能力明顯降低,說明CGI-58缺失會促進5-FU對巨噬細胞增殖活力的抑制作用。2.CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞周期的影響5-FU處理后CGI-58-KD與PLKO細胞的G1期細胞比例無明顯差異,說明CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞周期阻滯無顯著影響。3.CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡的影響5-FU處理后,CGI-58-KD比PLKO的凋亡細胞的比例明顯增加,且凋亡蛋白Caspase-3的表達水平明顯升高,說明CGI-58缺失會促進5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡。4.CGI-58缺失對巨噬細胞線粒體功能的影響與PLKO相比,CGI-58-KD細胞的OCR降低、ATP減少、ROS增多,揭示CGI-58缺失會損傷巨噬細胞的線粒體功能,導(dǎo)致ROS聚集。5.清除ROS后CGI-58缺失對巨噬細胞線粒體功能及5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖和凋亡的影響ROS抑制劑NAC阻斷后,CGI-58-KD與PLKO細胞的ROS生成基本一致,5-FU處理的CGI-58-KD與PLKO細胞的增殖能力無明顯差異,且凋亡蛋白Caspase-3的表達水平也無差異,說明清除活性氧(ROS)可消除CGI-58缺失對巨噬細胞線粒體功能的損傷和CGI-58缺失促進5-FU對巨噬細胞增殖活力的抑制作用以及CGI-58缺失對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡增加,綜上提示我們清除ROS后CGI-58缺失促進5-FU對巨噬細胞殺傷活性的效應(yīng)消失(二)在體實驗考察腫瘤相關(guān)巨噬細胞CGI-58對5-FU化療效果的抵抗作用1.CGI-58轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(TG~(CGI-58))只在腹腔原代巨噬細胞中轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))的CGI-58的表達水平明顯高于野生型小鼠(WT),說明轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))構(gòu)建成功。2.移植瘤(黑色素瘤)型中,去除巨噬細胞后5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腫瘤預(yù)后的影響將巨噬細胞去除后5-FU處理的轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))與野生型小鼠(WT)的體重和生存期均無明顯差異,說明轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))較之野生型小鼠(WT),5-FU化療預(yù)后差,但是巨噬細胞去除后,可消除這種差異,且預(yù)后變好,提示TAM抵抗5-FU對腫瘤的化療效果,使預(yù)后變差。3.移植瘤(黑色素瘤)模型中,5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腫瘤生長和預(yù)后的影響5-FU處理后轉(zhuǎn)基因(TG~(CGI-58))小鼠比野生型(WT)小鼠的體重輕、腫瘤生長快,生存期變短,說明巨噬細胞CGI-58過表達會抵抗5-FU對腫瘤的殺傷作用,預(yù)后變差。4.移植瘤(黑色素瘤)模型中,清除ROS后5-FU對轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)的腫瘤生長和預(yù)后的影響ROS抑制劑NAC阻斷后,5-FU處理的轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))與野生型小鼠(WT)的體重、腫瘤生長情況和生存期也無明顯差異,并且均比轉(zhuǎn)基因小鼠(TG~(CGI-58))+5-FU組的預(yù)后更差,這說明轉(zhuǎn)基因(TG~(CGI-58))小鼠較之野生型(WT)小鼠,5-FU化療預(yù)后差,而清除活性氧(ROS),不但可以消除上述這種差異而且巨噬細胞CGI-58過表達抵抗5-FU殺傷腫瘤的效應(yīng)也增強。結(jié)論:1.CGI-58缺失促進5-FU對巨噬細胞的殺傷作用,而CGI-58過表達抑制5-FU對巨噬細胞的殺傷作用。2.CGI-58對5-FU誘導(dǎo)的巨噬細胞殺傷敏感性的影響,主要是通過影響其凋亡而非周期阻滯。3.CGI-58影響5-FU對巨噬細胞的殺傷作用是通過影響巨噬細胞ROS的產(chǎn)生來實現(xiàn)的。4.巨噬細胞CGI-58抑制ROS生成,促進黑色素瘤TAM對5-FU的抵抗作用,進而減弱化療效果,使預(yù)后變差。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5

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本文編號：1351489