本文關(guān)鍵詞：microRNA-320d下調(diào)靶基因CDK6抑制人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:探討CDK6基因的表達(dá)與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)臨床病理特征之間的關(guān)系,驗(yàn)證hsa-micro RNA-320d(mi R-320d)靶向調(diào)控CDK6對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖的影響及分子機(jī)制。方法:(1)從被診斷為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的病例中,我們收集庫存于病理科檔案室的患者石蠟樣本84例,和詳細(xì)的隨訪資料,同時(shí)采用免疫組化En Vision兩步法對(duì)所收集的樣本進(jìn)行CDK6免疫標(biāo)記同時(shí)驗(yàn)證其表達(dá)水平。(2)利用三種生物信息學(xué)軟件(mi RDB,mi Randa,Targetscan)預(yù)測與mi R-320d的3’UTR端特異性結(jié)合的靶基因,螢火蟲熒光素酶活性則采用雙熒光素酶報(bào)告測定法去檢測,同時(shí)驗(yàn)證靶基因CDK6的3’UTR和mi R-320d的相互作用。(3)在構(gòu)建CDK6-sh RNA的慢病毒載體的基礎(chǔ)上選用成熟mi RNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染DLBCL細(xì)胞株。(4)CCK-8法和Annexin V-APC/7-AAD法檢測mi R-320d穩(wěn)定過表達(dá)和干擾CDK6對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖和凋亡的影響。(5)分別提取DLBCL組、mi R-320d過表達(dá)組及對(duì)照組三組的總蛋白,同時(shí)采用Western blotting技術(shù)來檢測CDK6蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)DLBCL患者組中CDK6基因的表達(dá)相較于濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma,FL)陰性對(duì)照組顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)成功篩選并預(yù)測出CDK6為mi R-320d的靶基因之一。CDK6 3’UTR與mi R-320d的特異性結(jié)合通過雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光素酶檢測得以證實(shí)。(3)敲低CDK6和mi R-320d過表達(dá)的慢病毒載體被成功構(gòu)建。相較于對(duì)照組,mi R-320d過表達(dá)組DLBCL細(xì)胞增殖能力降低,CDK6敲低組DLBCL細(xì)胞增殖降低,這些均通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)得以證實(shí),同時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)尚未證實(shí)CDK6干擾組與mi R-320d過表達(dá)組對(duì)DLBCL細(xì)胞凋亡率的影響是否有顯著差異。(4)采用DLBCL細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染mi R-320d過表達(dá)慢病毒載體與通用載體,并運(yùn)用Western blotting法驗(yàn)證兩者的數(shù)據(jù)結(jié)果。mi R-320d過表達(dá)組中CDK6蛋白表達(dá)相對(duì)低于對(duì)照組(0.04±0.04/0.87±0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。mi R-320d可能影響和調(diào)控DLBCL細(xì)胞中CDK6基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)論:CDK6蛋白在人DLBCL中高度表達(dá),提示CDK6可能作為癌基因,成為導(dǎo)致DLBCL高致死率及預(yù)后欠佳的主要因素之一。mi R-320d作用于基因的3’UTR,提示CDK6是mi R-320d直接調(diào)控的靶基因;鑒于mi R-320d對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖能力可通過靶向調(diào)控CDK6來抑制的特性,可將CDK6視作判斷DLBCL預(yù)后的潛在指標(biāo)之一,同時(shí)CDK6也是DLBCL生物實(shí)驗(yàn)治療的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.1

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1 徐夢微;microRNA-320d下調(diào)靶基因CDK6抑制人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1296173