本文關鍵詞：肝癌群體細胞3D培養(yǎng)模型的建立及其運動表型研究

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【摘要】：背景及目的:癌癥(cancer)是導致人類死亡的一個重要原因,每年全世界癌癥死亡的人數(shù)不斷增多,腫瘤惡性程度也在不斷提高。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界癌癥死亡率排名中排名第二位,其具有高轉(zhuǎn)移率,低預后率,難以治療等特點。腫瘤的惡性侵襲與轉(zhuǎn)移,導致患者腫瘤復發(fā),治療效果不佳,預后效果比較差。腫瘤細胞一旦轉(zhuǎn)化為惡性細胞,它的侵襲和遷移能力也會變得異常強大。腫瘤細胞并不只限于單個細胞的遷移。在許多腫瘤類型中,通常觀察到的侵襲單元是細胞群,群體的行為決定惡性功能。二維(two-dimensional,2D)細胞培養(yǎng)已廣泛應用于生物學研究,但在二維水平生長的細胞并不能精確地模擬體內(nèi)的狀態(tài)。相比于二維細胞培養(yǎng)的情況下,三維(three-dimensiona,3D)細胞培養(yǎng)通過運用再造細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)(比如Matrigel、collagen I等),能夠模擬體內(nèi)細胞生存環(huán)境,為細胞提供一個更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境,更有利于開展腫瘤細胞向周圍組織侵襲和遷移的研究。HAb18G/CD147分子是一種跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族黏附因子。其具有誘導肝癌細胞和周圍基質(zhì)成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),以降解肝癌組織周圍細胞外基質(zhì)的作用,進而促進肝癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移。本實驗室先前的研究發(fā)現(xiàn),HAb18G/CD147很有可能在肝癌群體細胞運動中發(fā)揮重要作用。盡管群體細胞運動概念很早就被提出來,但是,先前的研究重點都是群體細胞參與正常發(fā)育過程,包括原腸胚形成、腺管形成、血管形成、斑馬魚胚層發(fā)育中細胞的遷移等,在腫瘤中群體細胞侵襲運動的機制仍然不是很清楚。所以,明確肝癌群體細胞運動的具體表型,更有助于開展CD147調(diào)控腫瘤群體細胞運動的分子機制研究。方法:通過劃痕和transwell實驗,檢測三株人肝癌細胞遷移侵襲能力,免疫印跡實驗檢測在2D和3D培養(yǎng)條件下肝癌細胞遷移侵襲關鍵分子表達情況。運用Collagen I膠建立3D培養(yǎng)模型,將三株肝癌細胞系接種于膠原上,培養(yǎng)數(shù)天,石蠟包埋切片,HE染色方法評價模型建成情況�；诮⒌母伟┤后w細胞3D培養(yǎng)模型,運用免疫熒光染色方法對肝癌群體細胞運動關鍵分子,如HAb18G/CD147,鈣黏蛋白E-cadherin,黏著斑Vinculin等分子的表達及分布情況進行初步研究,同時選取肝癌臨床標本,運用HE染色方法,免疫組織化學染色方法對肝癌群體細胞運動關鍵分子的表達及分布情況進行研究。結(jié)果:劃痕和transwell實驗表明,三株人肝癌細胞都具有較強的遷移侵襲能力。免疫印跡實驗提示,3D培養(yǎng)條件下的肝癌細胞遷移侵襲關鍵分子表達明顯高于2D培養(yǎng)條件。運用3D培養(yǎng)模型培養(yǎng)的肝癌細胞,經(jīng)石蠟包埋切片,HE染色觀察,發(fā)現(xiàn)三株肝癌細胞都能夠向Collagen I膠中生長侵襲,并呈現(xiàn)群體樣運動。運用免疫熒光染色以及免疫組織化學染色,發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147分子在肝癌中高表達,并且主要分布在細胞膜上。E-cadherin分子也高表達于肝癌,主要分布在肝癌細胞與細胞連接處。Paxillin高表達于肝癌細胞中,促進黏著斑的形成。Vinculin分子在肝癌群體細胞中表現(xiàn)出極性分布,主要分布在群體細胞運動前緣,為群體細胞向前運動提供強大的粘附力。FAK在肝癌組織和正常組織中都有表達,但活化之后的FAK,即p-FAK高表達于肝癌細胞中。Vinculin在肝癌群體細胞中表現(xiàn)出極性分布,主要分布在群體細胞運動前緣,為群體細胞向前運動提供強大的粘附力。Rac1主要分布在群體細胞運動前緣,保證前緣細胞的突起形成。結(jié)論:成功建立肝癌群體細胞3D培養(yǎng)模型,通過運用3D肝癌培養(yǎng)模型制作的標本進行免疫熒光染色,以及肝癌臨床標本免疫組織化學染色,對肝癌群體細胞運動關鍵分子進行表達及分布分析,基本明確了肝癌群體細胞運動表型。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
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本文編號：1283290