本文關鍵詞：細胞自噬在門冬酰胺酶殺傷肺腺癌細胞中的作用和機制的研究

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【摘要】：研究背景支氣管肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,支氣管肺癌按照生物特性、治療方式及預后通常分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩類。肺腺癌是非小細胞肺癌中最常見的組織學亞型,同時也是發(fā)生于非吸煙者的最常見細胞學類型。因為肺腺癌具有發(fā)病率高、預后差、致死率高的特點,人們開始關注以細胞代謝為靶點(如天冬酰胺)的治療策略在肺腺癌治療中所發(fā)揮的作用。以天冬酰胺為靶點的門冬酰胺酶是目前FDA批準最有效的抗腫瘤酶制劑之一主要治療急性淋巴系白血病和某些髓系白血病的亞型。我們的研究首次報導門冬酰胺酶對肺腺癌的細胞毒作用并能誘導細胞凋亡。細胞自噬是真核細胞內(nèi)高度保守的長壽蛋白和細胞器的降解和再循環(huán)機制,對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、細胞增殖、分化及死亡等過程意義重大,并且與疾病治療尤其是腫瘤治療密切相關�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸缺乏,例如精氨酸的剝奪可以誘導細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。但是門冬酰胺酶是否可誘導肺腺癌細胞發(fā)生自噬尚未有報道,我們首次報導了門冬酰胺酶能夠誘導肺腺癌細胞A549和H1975發(fā)生細胞自噬,并且本實驗還對細胞自噬在門冬酰胺酶殺傷肺腺癌細胞中的作用和相關機制進行了研究。研究目的1.本項課題探究了靶向細胞自噬和天冬酰胺的策略用于肺腺癌治療的潛力,我們試圖探討門冬酰胺酶能否降解肺腺癌A549和H1975細胞胞外的天冬酰胺,并顯著抑制肺腺癌細胞的生長,誘導肺腺癌細胞凋亡。2.天冬酰胺剝奪是否能誘導肺腺癌細胞發(fā)生以自噬流(包括自噬體的形成、自噬體和溶酶體的融合、自噬體的降解三大階段)為表征的細胞自噬。并且抑制細胞自噬可否顯著提高門冬酰胺酶對肺腺癌細胞的細胞毒作用。3.我們試圖探究門冬酰胺酶對肺腺癌細胞的細胞毒作用同細胞自噬間的關系,并且評估了氧自由基在門冬酰胺酶殺傷肺腺癌細胞中的作用。本實驗試圖研究細胞自噬在天冬酰胺酶殺傷肺腺癌細胞中充當?shù)慕巧?靶向自噬和天冬酰胺的策略能否成為肺腺癌治療的新型方案。研究內(nèi)容和實驗結果1.A549和H1975細胞對門冬酰胺酶的敏感性與天冬酰胺合成酶缺陷有關。既往研究顯示天冬酰胺合成酶缺陷的腫瘤細胞對天冬酰胺剝奪治療策略敏感,因此我們使用western blot分析兩株肺腺癌細胞的天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase,ASNS)蛋白表達情況。分別抽提A549、H1975、K562及Jurkat細胞的總蛋白,用western blot分析,結果顯示,K562細胞表達天冬酰胺合成酶(ASNS)蛋白,而A549、H1975及Jurkat細胞不表達天冬酰胺合成酶(ASNS)蛋白。2.門冬酰胺酶對A549和H1975細胞的生長抑制作用。使用不同濃度的門冬酰胺酶處理A549和H1975細胞72h,采用MTT法測定各實驗組的細胞活力。我們可以觀察到門冬酰胺酶以濃度依賴的方式顯著抑制肺腺癌細胞A549和H1975的細胞生長。3.門冬酰胺酶誘導A549和H1975細胞的凋亡。我們運用Annexin V/PI雙標記染色的方法檢測細胞凋亡。兩株肺腺癌細胞經(jīng)不同濃度的門冬酰胺酶處理后,凋亡細胞所占的比率隨門冬酰胺酶濃度的增加而增多。4.門冬酰胺酶能激活A549和H1975細胞發(fā)生細胞自噬。我們采用透射電子顯微鏡、western blot和免疫熒光三種手段檢測自噬發(fā)生。首先,我們用門冬酰胺酶(1IU/mL)分別處理A549和H1975細胞,48h后收集并固定細胞,對兩株細胞進行包埋、切片及染色處理在透射電子顯微鏡下觀察它們的超微結構。未經(jīng)門冬酰胺酶處理的空白對照組的肺腺癌細胞A549和H1975鏡下細胞結構完整,其細胞核及核仁清楚；而經(jīng)門冬酰胺酶(1IU/mL)處理48h后的實驗組細胞胞核固縮變形,在高倍鏡下可見明顯的雙層膜結構。與空白對照組相比,門冬酰胺酶能顯著誘導兩株肺腺癌細胞自噬體的形成。然后,我們利用western blot技術檢測自噬相關蛋白LC3的變化。用0.25、0.5及1.0IU/mL門冬酰胺酶處理兩株肺腺癌細胞48h或者門冬酰胺酶(1IU/mL)處理A549和H1975細胞6h、12h及24h,分別抽提蛋白檢測自噬相關蛋白LC3的變化情況。門冬酰胺酶能明顯誘導兩株肺腺癌細胞LC3 Ⅱ的表達量增加并且具有劑量和時間依賴性,說明門冬酰胺酶能明顯誘導A549和H1975細胞發(fā)生細胞自噬。另一方面,為了進一步研究門冬酰胺酶誘導兩株肺腺癌細胞發(fā)生自噬的作用,本實驗還使用了熒光標記的方法觀測細胞自噬流的發(fā)生。Cyto-ID(?)染料是專門用于細胞自噬檢測的染料,它能特異性結合細胞內(nèi)自噬蛋白并產(chǎn)生綠色熒光。實驗組A549和H1975細胞分別用1IU/mL門冬酰胺酶處理12h、24h及48h,預處理完成后用Hoechst33342染細胞核(藍),Cyto-ID Green Dye指示自噬體(綠),LysoTracker Red DND 99染溶酶體(紅)。我們通過熒光顯微鏡可以發(fā)現(xiàn)門冬酰胺酶誘導兩株肺腺癌細胞發(fā)生自噬流的三個階段：第12h自噬體形成(綠色),第24h自噬體和溶酶體發(fā)生融合(黃色),第48h自噬體被溶酶體降解(橙色),結果顯示天冬酰胺耗竭可以誘導肺腺癌細胞發(fā)生自噬流。5.自噬抑制劑氯喹與門冬酰胺酶聯(lián)用增加肺腺癌細胞LC3 Ⅱ蛋白的表達。為了探究自噬在門冬酰胺酶殺傷肺腺癌細胞A549和H1975中的作用,本研究采用自噬抑制劑氯喹抑制門冬酰胺酶誘導的細胞自噬。氯喹作為自噬抑制劑,可以通過提高胞質的pH值在自噬終末階段阻止自噬體同溶酶體的融合,導致自噬相關蛋白LC3 Ⅱ的過表達。Western blot結果顯示門冬酰胺酶能引起A549和H1975細胞中LC3 Ⅱ的表達量增加,而聯(lián)用氯喹能上調門冬酰胺酶誘導的LC3 Ⅱ的表達,表明氯喹能有效抑制門冬酰胺酶誘導的細胞自噬。6.自噬抑制劑氯喹增強門冬酰胺酶對肺腺癌細胞的細胞毒作用。使用自噬抑制劑氯喹與門冬酰胺酶聯(lián)合或單獨使用門冬酰胺酶處理A549和H1975細胞72h,采用MTT法測定各實驗組的細胞活力。細胞活力以570nm波長下測定的吸光值換算成的存活細胞百分數(shù)表示。實驗結果顯示,與單獨使用門冬酰胺酶處理組相比,自噬抑制劑氯喹與門冬酰胺酶聯(lián)合使用可顯著增強門冬酰胺酶對A549和H1975細胞的生長抑制作用。7.使用siRNA特異性沉默自噬相關蛋白ATG5。為深入探究抑制細胞自噬強化門冬酰胺酶殺傷肺腺癌細胞的作用,本實驗采用RNA干擾技術特異性沉默細胞自噬相關基因5(ATGS)的表達,并在此基礎上研究抑制細胞自噬對門冬酰胺酶抑制A549和H1975細胞生長作用的影響。我們采用siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2選擇性下調ATG5,Western blot顯示,同si-Contorl干擾組相比,siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2干擾組ATG蛋白的表達量明顯減少,說明si-ATG5成功沉默了ATG5的表達。8.使用siRNA沉默自噬相關蛋白ATG5能顯著增強門冬酰胺酶對A549和H1975細胞的細胞毒作用。在上述基礎上,MTT結果顯示,與si-Control干擾組的門冬酰胺酶對A549和H1975細胞的生長抑制作用相比,siRNA-ATG5-1/siRNA-ATG5-2干擾組能明顯提高門冬酰胺酶對兩株肺腺癌細胞的細胞毒作用。9.抑制細胞自噬可增強門冬酰胺酶誘導A549和H1975細胞發(fā)生凋亡作用。我們探討門冬酰胺酶誘導的細胞自噬和細胞凋亡的關系,首先使用自噬抑制劑氯喹聯(lián)合門冬酰胺酶預處理A549和H1975細胞24h,收集細胞流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示,單獨使用門冬酰胺酶組細胞凋亡率分別是14.7%和18.9%,而自噬抑制劑氯喹和門冬酰胺酶共同作用組誘導AnnexinV陽性的細胞比例增加,A549和H1975細胞的凋亡率分別是32%和47%。說明自噬抑制劑氯喹抑制細胞自噬能明顯增強門冬酰胺酶誘導兩株肺腺癌細胞的細胞凋亡。10.自噬抑制劑氯喹和門冬酰胺酶聯(lián)用能增強caspase3的活性。自噬抑制劑氯喹聯(lián)合門冬酰胺酶處理A549和H1975細胞48h,或者單獨使用門冬酰胺酶或氯喹處理兩株細胞48h,然后使用caspase3活性檢測試劑盒檢測各實驗組caspase3活性。同空白對照組相比,自噬抑制劑氯喹聯(lián)合門冬酰胺酶組的caspase3活性顯著提高。11.z-VAD-fink能顯著減弱門冬酰胺酶誘導肺腺癌細胞誘導的生長抑制。使用caspase廣譜抑制劑z-VAD-frnk與門冬酰胺酶及自噬抑制劑聯(lián)合使用或單獨處理兩株肺腺癌細胞,運用MTT法檢測細胞活力的變化。同單獨使用門冬酰胺酶處理組或氯喹聯(lián)合門冬酰胺酶處理組相比,運用z-VAD-fink抑制caspase的剪切后,門冬酰胺酶對A549和H1975細胞的生長抑制作用明顯減弱。綜上所述,抑制自噬能增強門冬酰胺酶誘導的A549和H1975細胞的caspase3依賴的凋亡。12.N-乙酰半胱氨酸(N-acety-cysteine,NAC)抑制門冬酰胺酶誘導肺腺癌發(fā)生細胞自噬和線粒體產(chǎn)生氧自由基。為了探究氧自由基在門冬酰胺酶誘導肺腺癌細胞發(fā)生細胞自噬和細胞毒作用中所扮演的角色,我們使用抗氧化劑NAC和門冬酰胺酶聯(lián)合處理A549和H1975細胞48h,然后分別使用Mitosox、Cyto-ID標記線粒體氧自由基和自噬體。門冬酰胺酶處理組中紅色熒光提示線粒體氧自由基的產(chǎn)生,綠色熒光提示自噬體形成,而抗氧化劑NAC和門冬酰胺酶聯(lián)合處理組中紅色熒光和綠色熒光強度明顯減弱,提示抑制氧自由基能減弱門冬酰胺酶誘導A549和H1975細胞發(fā)生細胞自噬的作用。13.清除氧自由基削弱門冬酰胺酶對肺腺癌細胞的細胞毒作用。我們利用抗氧化劑NAC和門冬酰胺酶處理A549和H1975細胞,或者門冬酰胺酶單獨處理兩株肺腺癌細胞,48h后用MTT法檢測細胞活力。同門冬酰胺酶單獨處理組相比,抗氧化劑NAC和門冬酰胺酶聯(lián)合處理組的肺腺癌細胞的活力顯著提升。此項結果表明氧自由基介導了門冬酰胺酶對A549和H1975細胞的細胞毒作用。14.抑制自噬能增強門冬酰胺酶誘導肺腺癌細胞產(chǎn)生的氧自由基的作用。本實驗使用門冬酰胺酶聯(lián)合自噬抑制劑氯喹處理A549和H1975細胞,或者門冬酰胺酶單獨處理兩株肺腺癌細胞,48h后Mitosox染色標記線粒體氧自由基的產(chǎn)生。同門冬酰胺酶單獨處理組相比,氯喹和門冬酰胺酶聯(lián)合處理組能觀察到信號更強的紅色熒光,實驗結果提示抑制自噬能增強門冬酰胺酶誘導肺腺癌細胞產(chǎn)生的氧自由基。實驗結論綜上所述,門冬酰胺酶對肺腺癌細胞具有明顯的細胞毒性和誘導細胞凋亡的作用。門冬酰胺酶能引起肺腺癌細胞發(fā)生細胞自噬,并且抑制細胞自噬可顯著提高門冬酰胺酶對肺腺癌細胞的細胞毒作用。此外,氧自由基也介導了門冬酰胺酶對肺腺癌細胞的殺傷作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1230930