本文關(guān)鍵詞：miR-206通過抑制NK1R-FL表達促進乳腺癌生長的機制研究

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【摘要】：研究背景和目的:乳腺癌是女性最常見的癌癥,是引起女性癌癥相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。神經(jīng)肽P物質(zhì)(Substance P,SP)是速激肽家族的重要成員,通過與其受體NK1R(Neurokinin-1 receptor,NK1R)結(jié)合在人類乳腺癌的發(fā)生和進展中起著重要的作用。目前為止發(fā)現(xiàn)NK1R有兩種亞型:全長型受體(full-length NK1R)NK1R-FL和胞內(nèi)端缺少96個氨基酸殘基的截短型受體(truncated NK1R)NK1R-Tr。我們前期研究顯示乳腺癌細胞中NK1R-FL的表達與乳腺癌的進展呈負相關(guān),并通過生物學信息學研究發(fā)現(xiàn)miR-206可以靶調(diào)控人NK1R-FL基因。MicroRNA(miRNA)可以通過與其靶基因mRNA 3’端非編碼區(qū)(3’Untranslated regions,3’-UTR)以堿基互補配對的方式結(jié)合,使靶基因mRNA降解或翻譯受到抑制,負向調(diào)控靶基因的表達。mi RNA在腫瘤中參與其發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等多個病理過程。本課題旨在研究乳腺癌中miR-206與NK1R-FL的表達水平之間的關(guān)系,進一步,進一步在細胞水平進行驗證,并探索miR-206/NK1R-FL信號通路對乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖等生物學行為的影響。研究方法:1.組織水平:乳腺癌組織中mi R-206與NK1R-FL的表達分析。收集82對乳腺癌組織及其配對的癌旁組織,提取總RNA,用qRT-PCR檢測組織中NK1R-FL和miR-206表達水平;用免疫組織化學方法檢測總NK1R和NK1R-FL在乳腺癌組織及其配對的癌旁組織中的表達情況;用qRT-PCR檢測乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3和非腫瘤源性的乳腺上皮系HBL-100中NK1R-FL和mi R-206表達水平;通過Pearson’s相關(guān)分析檢驗miR-206與NK1R-FL mRNA的表達水平相關(guān)性。2.靶點預測及相互調(diào)控的驗證:NK1R-FL的3’-UTR是否存在miR-206的靶向結(jié)合位點及相互調(diào)控作用。通過TargetScan、PicTar、mi Rnada等生物信息學軟件初步預測了NK1R-FL的3’-UTR存在三個miR-206的靶向結(jié)合位點并通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證;然后在乳腺癌細胞系SK-BR-3和非腫瘤源性的乳腺上皮HBL-100中轉(zhuǎn)染miR-206 mimics,在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitors,westernblot及qrt-pcr檢測nk1r-fl的表達水平。3.sp-nk1r信號通路分析:驗證mir-206通過靶調(diào)控nk1r-fl對乳腺癌細胞ca2+內(nèi)流及信號通路的改變。通過檢測胞內(nèi)ins(1,4,5)p3濃度的變化來探究mir-206在nk1r-fl依賴細胞內(nèi)信號傳導的過程中的作用;通過觀察未轉(zhuǎn)染(nc)組和轉(zhuǎn)染了mir-206mimic組乳腺癌細胞p-erk1/2的改變來探究mir-206通過靶調(diào)控nk1r-fl對乳腺癌細胞erk1/2信號通路的作用。4.生物學行為影響研究:驗證mir-206-nk1r-fl信號通路對乳腺癌細胞生物學行為的影響。首先在乳腺癌細胞系sk-br-3中轉(zhuǎn)染mir-206mimics/negativecontrol,并通過cck8增殖實驗,transwell侵襲和轉(zhuǎn)移及克隆形成實驗驗證mir-206對乳腺癌細胞增殖、侵襲及克隆形成能力的影響。在乳腺癌細胞系mda-mb-231中轉(zhuǎn)染mir-206inhibitor/inhibitorcontrol,并通過cck8增殖實驗,transwell侵襲和轉(zhuǎn)移及克隆形成實驗驗證mir-206對乳腺癌細胞增殖、侵襲及克隆形成能力的影響。結(jié)果:1.乳腺癌組織mir-206與nk1r-fl的表達分析:與癌旁組織相比,乳腺癌組織中nk1r-fl蛋白水平較低,mir-206的表達水平較高,且均與乳腺癌的腫瘤分期分級及有無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。與非腫瘤源性人乳腺上皮細胞系hbl-100相比,nk1r-fl在乳腺癌細胞系mda-mb-231、mcf-7、t47d、sk-br-3表達水平較低,mir-206的表達水平則相對較高。且在乳腺癌組織中,mir-206與nk1r-flmrna的表達水平呈負相關(guān)關(guān)系。2.靶點預測及相互調(diào)控的驗證:通過生物信息軟件預測了在nk1r-fl的3’-utr區(qū)存在mir-206的3個靶向結(jié)合位點,接著又通過細胞水平的熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證mir-206可直接與nk1r-fl的3’-utr區(qū)結(jié)合對其進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控;在乳腺癌細胞系sk-br-3和非腫瘤源性的乳腺上皮hbl-100中轉(zhuǎn)染mir-206mimics后nk1r-fl的mrna及蛋白水平均下降;在乳腺癌細胞系mda-mb-231中轉(zhuǎn)染了mir-206inhibitors后nk1r-fl的mrna及蛋白水平均升高。3.sp-nk1r信號通路分析:mir-206通過下調(diào)nk1r-fl的表達從而使胞內(nèi)ins(1,4,5)p3的水平降低,從而使ca2+內(nèi)流的時間延長;mir-206通過下調(diào)NK1R-FL的表達從而使胞內(nèi)ERK1/2的激活時間延長。4.生物學行為影響研究:mi R-206可直接與NK1R-FL的3’-UTR區(qū)結(jié)合,發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,引起NK1R-FL表達水平下降,從而促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、克隆形成和增殖。結(jié)論:乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中miR-206高表達、NK1R-FL低表達,隨乳腺癌進展兩者表達呈負相關(guān);miR-206通過靶抑制NK1R-FL表達作用下游信號通路從而促進乳腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、克隆形成和增殖。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1219091