本文關(guān)鍵詞：粒細胞集落刺激因子通過促進腎臟分泌EPO刺激小鼠脾紅細胞生成作用的研究

  更多相關(guān)文章： 粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 脾紅細胞生成 促紅細胞生成素(EPO) 腎臟 骨髓紅細胞生成

【摘要】：[研究背景]粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是體內(nèi)重要的細胞因子,能促進粒細胞生成和增強粒細胞活性,臨床上用于治療各種原因引起的粒細胞減少癥和動員造血干/祖細胞用于造血干/祖細胞移植。近期有文獻研究提示G-CSF可促進腫瘤轉(zhuǎn)移和加重腫瘤患者貧血癥狀；G-CSF動員造血干細胞之后,會造成健康捐獻者造血干細胞長時間基因表達異常；長時間使用G-CSF治療先天性粒細胞減少癥可增加患白血病的概率；而我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn),分泌G-CSF的乳腺癌細胞可造成小鼠紅細胞生成系統(tǒng)紊亂,骨髓紅細胞生成受到抑制,脾紅細胞生成功能增強。促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)是紅細胞生成的關(guān)鍵細胞因子,機體內(nèi)的EPO主要是由腎小管間質(zhì)細胞分泌。G-CSF是否可通過改變機體EPO水平影響造血系統(tǒng),目前尚缺乏有效的文獻支持。研究G-CSF誘導(dǎo)紅細胞生成系統(tǒng)功能紊亂的機制,從不同角度評價G-CSF對機體的作用,可使我們更好的理解G-CS F的藥理活性和不良反應(yīng),并有助于進一步闡明G-CSF與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為G-CSF臨床合理用藥和腫瘤治療提供重要參考；同時可拓展我們對脾臟功能的認識,有利于深入理解機體紅細胞生成系統(tǒng)的調(diào)控機制。[研究目的]研究粒細胞集落刺激因子(G-CSF)誘導(dǎo)脾臟紅細胞生成的作用機制,分析EPO在脾紅細胞生成中的功能,評價腎臟功能對脾紅細胞生成能力的影響。[研究方法]1.給予C57BL/6J小鼠皮下注射粒細胞集落刺激因子G-CSF,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119 (或APC Rat Anti-Mouse Ter119)和PE Rat Anti-MouseCD71雙參數(shù)標記,流式細胞儀檢測小鼠骨髓細胞和脾細胞中Ter119和CD71雙陽性(CD71+Ter119+)細胞群體所占比例。2.給予小鼠皮下注射G-CSF,采用APC Rat Anti-Mouse Ter119 和 Thiazole orange雙參數(shù)標記,流式細胞儀檢測小鼠骨髓細胞和脾臟細胞中網(wǎng)織紅細胞(Ter119+Thiazole orange+)和有核紅細胞(原紅細胞和幼紅細胞,Ter119+Thiazole orange++)占總細胞比例。3.給予小鼠皮下注射G-CSF,對小鼠骨髓與外周血進行細胞涂片,采用Wright-Giemsa染色,顯微鏡下觀察。4.給予皮下注射G-CSF,取小鼠脾臟細胞原代培養(yǎng)CFU-E (Colony Forming Units-erythrocyte),顯微鏡下觀察CFU-E集落形成情況。5.為探究G-CSF誘導(dǎo)的脾臟紅細胞生成作用是否與EPO有關(guān),給予小鼠皮下注射G-CSF,心臟取血,離心取血清,采用ELISA方法檢測小鼠血清中EPO的濃度。6.給予小鼠皮下注射G-CSF,取小鼠腎臟,提取組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄成DNA后通過RT-PCR檢測小鼠體內(nèi)腎臟組織中EPO的mRNA水平。7.給予小鼠皮下注射促紅細胞生成素EPO,取小鼠脾臟,制成單細胞懸液,采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+各細胞群體所占比例。8.給予小鼠體內(nèi)注射EPO,取小鼠脾臟,制成單細胞懸液,Ter119/噻唑橙雙染流式檢測小鼠脾臟中Ter119+ Thiazole orange+(網(wǎng)織紅細胞),Ter119+ Thiazole orange++(原紅細胞和幼紅細胞)群體所占比例。9.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時,給予小鼠尾靜脈輸紅細胞,采用FITC Rat Anti-Mouse Terl 19/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞所占比例。采用Ter119/噻唑橙雙染流式檢測小鼠脾臟細胞,觀察網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。10.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時,給予小鼠注射EPO抗體,封閉小鼠體內(nèi)EPO,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞群體所占比例。采用Ter119/ Thiazole orange雙染流式檢測小鼠脾臟細胞,觀察網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。11.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時,給予小鼠喂服腺嘌呤,破壞小鼠雙腎,阻斷EPO分泌,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞群體所占比例。采用Ter119/Thiazole orange雙染流式檢測小鼠脾臟細胞,觀察網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。12.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF,后對實驗組小鼠實施雙側(cè)腎臟切除手術(shù),阻斷EPO來源。2天后,處死小鼠,采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞群體所占比例。采用Ter119/噻唑橙雙染流式檢測小鼠脾臟細胞,觀察成熟紅細胞,網(wǎng)織紅細胞與原紅幼紅細胞所占比例。13.給予小鼠體內(nèi)注射G-CS F,分別給藥1天、2天,取小鼠腎臟,提蛋白,采用免疫印跡法檢測在受G-CSF刺激后小鼠腎臟中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α、HIF-2a的表達情況。[研究結(jié)果]1.在給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF后,小鼠股骨變白,骨髓細胞數(shù)減少,細胞中Ter119+CD71+細胞比例下降。相對應(yīng)小鼠脾臟變大,顏色加深,細胞數(shù)增多,細胞中Ter119+CD71+細胞比例上升。2.在給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF后,噻唑橙染色結(jié)果得出小鼠脾臟細胞Ter119+Thiazole orange+,Ter119+Thiazole orange++群體均有顯著上升,而小鼠骨髓細胞中Ter119+ Thiazole orange+, Ter119+ Thiazole orange++細胞均明顯減少。3.細胞涂片結(jié)果顯示：注射了G-CSF、鼠的骨髓細胞中紅細胞數(shù)減少,粒細胞數(shù)增多。注射了G-CSF小鼠的外周血細胞涂片結(jié)果顯示：外周血中粒細胞總數(shù)增多。4.原代培養(yǎng)CFU-E結(jié)果顯示,皮下注射G-CSF后小鼠脾臟細胞中CFU-E明顯增多。5. ELISA測定小鼠血清中EPO結(jié)果顯示,給予小鼠G-CSF刺激以后,小鼠血清中EPO水平明顯上升。6. RT-PCR結(jié)果顯示,在給與小鼠G-CSF刺激后,小鼠腎臟中EPO的mRNA水平顯著上升。7.檢測受G-CSF刺激的小鼠腎臟中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α 與 HIF-2α表達水平。Western b lot結(jié)果顯示,給與小鼠G-CSF刺激后,小鼠腎臟中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α 與 HIF-2α表達水平上升。8.給予小鼠外源性EPO刺激后,小鼠脾臟細胞中Ter119+CD71+細胞比例上升。APC Rat Anti-Mouse Ter119和噻唑橙染色結(jié)果顯示脾臟細胞中Ter119+ Thiazole orange+(網(wǎng)織紅細胞),Ter119+ Thiazole orange++(原紅細胞和幼紅細胞)群體均有顯著上升。9.在使用G-CSF刺激小鼠后,給小鼠尾靜脈輸入紅細胞,流式檢測脾臟細胞,發(fā)現(xiàn)相比G-CSF給藥組,G-CSF給藥同時輸紅細胞組Ter119+CD71+細胞比例,Ter119+Thiazole orange+, Ter119+Thiazole orange++細胞比例降低至正常對照組小鼠水平。10.在小鼠受到G-CSF刺激的情況下,給小鼠注射一定量的EPO抗體封閉小鼠體內(nèi)EPO的功能,流式檢測脾臟細胞,發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細胞比例,Ter119+ Thiazole orange+,ter119+Thiazole orange++細胞比例恢復(fù)至正常對照組小鼠水平。11.在小鼠受到G-CSF刺激的情況下,同時給予小鼠喂服腺嘌呤,小鼠脾臟細胞數(shù)恢復(fù)正常,流式細胞儀檢測其脾臟細胞,發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細胞比例,Ter119+Thiazole orange+,ter119+ Thiazole orange++細胞比例恢復(fù)至正常對照組水平。如果同時再給脾臟恢復(fù)正常的小鼠外源EPO刺激,脾臟再度增大,細胞數(shù)增多,Ter119+CD71+細胞比例,Ter119+ Thiazole orange+, Ter119+ Thiazole orange++細胞比例再次上升。12.給小鼠G-CSF刺激一段時間后,切除小鼠雙側(cè)腎臟,兩天后取脾臟,發(fā)現(xiàn)鼠脾臟明顯縮小,流式檢測其脾臟細胞,發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細胞比例,Ter119+Thiazole orange+,ter119+ Thiazole orange++細胞比例相比G-CSF給藥組亦明顯降低。而后再給脾臟恢復(fù)正常的小鼠外源EPO刺激,脾臟再度增大,Ter119+CD71+細胞比例,Ter119+ Thiazole orange+,Ter119+ Thiazole orange++細胞比例再次上升。[結(jié)論]粒細胞集落刺激因子(G-CSF)抑制小鼠骨髓紅細胞生成,造成機體缺氧,促進腎臟缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α表達,進而促進腎臟間質(zhì)細胞分泌促紅細胞生成素(EPO),然后刺激小鼠脾臟紅細胞生成。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊莉,應(yīng)連城,謝海峰;健康幼嬰紅細胞肌酸含量與紅細胞生成狀態(tài)的關(guān)系[J];蚌埠醫(yī)學院學報;1992年03期

2 葉秀君;;正常妊娠期胎兒和母體紅細胞生成的調(diào)節(jié)[J];國外醫(yī)學.婦產(chǎn)科學分冊;1983年05期

3 林慧嫻;紅細胞生成刺激素對各類貧血的臨床應(yīng)用[J];醫(yī)師進修雜志;2000年11期

4 ;用促紅細胞生成控制癌癥相關(guān)性貧血[J];中華醫(yī)學信息導(dǎo)報;2003年08期

5 孟憲法;;低氧紅細胞生成調(diào)節(jié)機制的研究進展[J];青海醫(yī)學院學報;1993年01期

6 ;延長高原（6542m）暴露對人紅細胞生成的影響[J];高原醫(yī)學雜志;1995年01期

7 陳璋璋,許青;新型紅細胞生成刺激蛋白[J];世界臨床藥物;2003年04期

8 黃梓倫;紅細胞增多癥血漿中的紅細胞生成刺激素[J];國外醫(yī)學.輸血及血液學分冊;1980年02期

9 李春元;;去鐵胺改善長期血液透析患者的紅細胞生成[J];國外醫(yī)學.輸血及血液學分冊;1989年02期

10 余英豪;純紅細胞發(fā)育不全患者血清紅細胞生成抑制物[J];國外醫(yī)學.輸血及血液學分冊;1992年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 尹洪剛;胡敏;徐峰鵬;;抗阻訓(xùn)練對骨髓抑制大鼠紅系造血能力的影響[A];2013年中國生理學會運動生理學專業(yè)委員會年會暨“運動與健康”學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 王小龍;紅細胞生成過程存在分子控制“開關(guān)”[N];科技日報;2010年

2 王樂民;癌癥引起的貧血不能用促紅細胞生成類藥治療[N];健康報;2007年

3 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 副主任醫(yī)師 王延;六、紅細胞生成主要靠哪些原料[N];家庭醫(yī)生報;2003年

4 孫慶偉;紅細胞的“一生”[N];家庭醫(yī)生報;2007年

5 本報記者 慕欣;腫瘤相關(guān)性貧血國內(nèi)外指南分析[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2011年

6 段明輝 孟嬋 韓冰;貧血與癌癥[N];健康報;2005年

7 肖祥云;健康老人也會貧血[N];中國老年報;2004年

8 無錫市第一醫(yī)院副主任藥師 陸基宗;缺血補鐵還應(yīng)補銅[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉敏;小鼠乳腺癌模型中G-CSF介導(dǎo)的脾臟病理性紅細胞生成作用及機制[D];山東大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 金星;粒細胞集落刺激因子通過促進腎臟分泌EPO刺激小鼠脾紅細胞生成作用的研究[D];山東大學;2016年

，

本文編號：1213590