本文關(guān)鍵詞：CRKL過表達抑制小鼠肝癌Hca-P細胞體外增殖,遷移和侵襲能力

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【摘要】：背景:轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要生物學(xué)特征,涉及細胞外基質(zhì)降解和細胞遷移等復(fù)雜過程,一直是腫瘤防治的重大課題和難點。淋巴結(jié)通常是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的第一個器官,惡性腫瘤早期淋巴道轉(zhuǎn)移是患者死亡率高預(yù)后性差的重要原因,是一個涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程,包括腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程,其轉(zhuǎn)移機制不清。小鼠肝癌腹水型細胞株Hca-P和Hca-F是一對小鼠肝癌亞克隆細胞系,它們的遺傳背景相同,但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能是顯著不同的,其中Hca-P為低淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25%),Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約75%),是研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的理想細胞模型。信號接頭蛋白CRKL,是CRK家族成員之一,在真核生物體內(nèi)廣泛表達,參與多種致癌信號通路,與一些癌癥的臨床病理學(xué)特征及預(yù)后密切相關(guān),已成為腫瘤學(xué)研究的熱點分子。本課題組前期采用Western blot技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),CRKL在Hca-P中的表達是Hca-F中的3.05倍(P0.05),并通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Hca-P細胞CRKL表達水平,發(fā)現(xiàn)CRKL下調(diào)明顯促進Hca-P細胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能,提示CRKL的表達水平與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能是潛在的抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)分子。目的:1.構(gòu)建pc DNA3.1-V5/His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒;2.瞬時轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-CRKL質(zhì)粒至小鼠肝癌Hca-P細胞,激光共聚焦定位CRKL-GFP融合蛋白;3.瞬時轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-V5/His B-CRKL質(zhì)粒至小鼠肝癌Hca-P細胞,Western blot檢測CRKL蛋白過表達水平;4.探究瞬時轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-V5/His B-CRKL質(zhì)粒后,CRKL過表達對Hca-P細胞體外增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力的影響,為進一步研究淋巴道轉(zhuǎn)移機制奠定基礎(chǔ)。方法:1.根據(jù)CRKL的CDS及pc DNA3.1/V5-His B和p EGFP-N1載體,對應(yīng)設(shè)計引物對-1和引物對-2;2.RT-PCR方法擴增小鼠CRKL的CDS全長,產(chǎn)物純化后與p EASY-blunt simple cloning vector進行克隆,獲得原核克隆質(zhì)粒p EASY-blunt simple-CRKL-1和p EASY-blunt simple-CRKL-2,分別進行單雙酶切及測序鑒定。將原核克隆質(zhì)粒、pc DNA3.1/V5-His B和p EGFP-N1空質(zhì)粒分別進行雙酶切,純化目的片段并連接,獲得pc DNA3.1/V5-His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒,并分別進行單雙酶切及測序鑒定;3.采用Lipofectamine#174;2000轉(zhuǎn)染試劑,將p EGFP-N1-CRKL及p EGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌Hca-P細胞,轉(zhuǎn)染24小時后,倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,激光共聚焦顯微鏡定位CRKL-GFP融合蛋白;4.采用Lipofectamine#174;2000轉(zhuǎn)染試劑,將pc DNA3.1/V5-His B-CRKL及pc DNA3.1/V5-His B空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌Hca-P細胞,轉(zhuǎn)染24小時后,采用Western blot檢測CRKL蛋白過表達水平;5.CCK-8法檢測CRKL表達上調(diào)對Hca-P細胞增殖能力的影響,軟瓊脂克隆形成法檢測CRKL表達上調(diào)對Hca-P細胞克隆形成能力的影響,Transwell小室法檢測CRKL表達上調(diào)對Hca-P細胞體外遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果:1.酶切及測序結(jié)果顯示,p EASY-blunt simple-CRKL-1和p EASY-blunt simple-CRKL-2克隆質(zhì)粒、pc DNA3.1-V5/His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功,重組質(zhì)粒中CRKL序列完全正確;2.激光共聚焦結(jié)果顯示,CRKL蛋白主要表達于細胞質(zhì)中;3.Western blot結(jié)果顯示,與pc DNA3.1/V5-His B-Hca-P和Hca-P組相比,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P組CRKL與CRKL-His總表達水平分別上調(diào)了1.69和1.39倍,且只有pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P組檢測到CRKL-His Tag融合蛋白;4.CCK-8細胞增殖結(jié)果顯示,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P與對照組相比細胞增殖速度明顯減慢;軟瓊脂克隆形成結(jié)果顯示,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P與對照組相比細胞克隆形成能力明顯降低;Transwell小室結(jié)果顯示,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P與對照組細胞相比細胞遷移以及細胞侵襲能力顯著下降。結(jié)論:1.成功構(gòu)建了p EASY-blunt simple-CRKL-1和p EASY-blunt simple-CRKL-2克隆質(zhì)粒;成功構(gòu)建了pc DNA3.1/V5-His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒;2.CRKL蛋白主要分布于Hca-P細胞質(zhì)中;3.CRKL過表達抑制Hca-P細胞的增殖能力;4.CRKL過表達抑制Hca-P細胞的克隆形成能力;5.CRKL過表達抑制Hca-P細胞的遷移能力;CRKL過表達抑制Hca-P細胞的侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3

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本文編號：1208032