本文關鍵詞：論文一：IL-17D在肺臟腫瘤免疫編輯中的作用 論文二：小劑量全身輻射后T細胞免疫重建特點及肉桂的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：研究背景:肺癌是世界最常見的惡性腫瘤之一,臨床診斷發(fā)現(xiàn)時肺癌往往已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。近年來,越來越多的研究開始關注腫瘤微環(huán)境在肺癌中的作用。2002年美國生物學家Shreigber提出腫瘤免疫編輯(tumor immunoediting)學說,該理論認為腫瘤發(fā)展包括3個階段,即清除(elimination)、平衡(equilibrium)及逃逸(escape)。隨著免疫編輯的進展,腫瘤細胞不斷增值、惡化,同時伴隨抗腫瘤免疫的失勢,以及局部組織結(jié)構(gòu)的破壞。而局部組織結(jié)構(gòu)的破壞(包括局域細胞因子及趨化因子分泌模式的改變)又影響淋巴細胞的局部招募及功能表型,從而加速了免疫失勢,進而促進腫瘤惡化,如此形成惡性循環(huán)。組織基質(zhì)細胞是最早感知免疫編輯的細胞群體,其如何通過細胞因子及趨化因子影響免疫失勢研究較少,是我們關注的焦點。IL-17家族是感知粘膜組織破壞最為敏感的危險感受器(danger sensor),其家族成員中,關于IL-17D的研究很少,有研究指出其主要表達于肺臟、骨骼肌,我們前期的研究發(fā)現(xiàn)IL-17D主要由CD45-細胞表達。在此基礎上,了解IL-17D在肺臟組織中的具體來源細胞,闡明其在肺癌局域微環(huán)境中的作用。并探討NK細胞、CD8+T細胞肺臟遷移模式、表型特征和功能變化規(guī)律,認識IL-17D缺失影響NK細胞肺臟遷移、表型和功能的調(diào)節(jié)機制。研究目的:1.我們前期的研究發(fā)現(xiàn)肺臟中IL-17D主要由CD45-細胞表達。在此基礎上,在小鼠肺臟腫瘤生長過程中,針對肺臟幾種基質(zhì)細胞,探討肺臟IL-17D的主要細胞來源和表達變化趨勢。2.明確NK、CD8+T細胞肺臟遷移模式、表型特征和功能變化規(guī)律,認識IL-17D缺失影響NK細胞肺臟遷移、表型和功能的調(diào)節(jié)機制。研究方法:1.建立B16轉(zhuǎn)移性肺癌、皮膚癌、小腸癌小鼠模型;采用滴鼻吸入IL-17D制劑的方式給予小鼠外源性補充IL-17D。2.實時定量熒光PCR技術檢測小鼠肺臟、皮膚、小腸組織的IL-17D表達;q-PCR技術檢測小鼠肺臟趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、S1Pr5及細胞因子S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF、IL-22、IL-23、IL-1β、TNF-a的m RNA表達。3.流式細胞胞內(nèi)外因子雙染法檢測小鼠肺臟成纖維細胞的IL-17D分泌水平;流式細胞術檢測小鼠肺臟CD4+T、CD8+T、NK細胞比例及其分泌IFN-γ水平。4.采用膠原酶消化法及組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代小鼠肺成纖維細胞及人胚胎肺成纖維細胞,并采用差時貼壁法進行純化,采用流式細胞術檢測表面標志進行鑒定。5.腫瘤細胞與肺成纖維細胞不同比例共培養(yǎng),腫瘤培養(yǎng)上清與肺成纖維細胞不同濃度共培養(yǎng),RT-PCR技術檢測肺成纖維細胞IL-17D、CXCL9、CXCL10的m RNA表達。6.為進一步驗證IL-17D對肺臟成纖維細胞局域招募NK及CD8+T細胞的影響及機制,將肺成纖維細胞種于下室,采用肺癌細胞LLC細胞上清及IL-17D對肺成纖維細胞進行刺激,并將其與外周血、肺臟、脾臟中的淋巴細胞采用Transwell共培養(yǎng),采用流式細胞術檢測進入下室的淋巴細胞中NK及CD8+T細胞的比例。RT-PCR技術檢測下室肺成纖維細胞IL-17D、CXCL10、IL-15的m RNA表達。研究結(jié)果:1.IL-17D在腫瘤組織中表達下降。q-PCR及流式細胞術的結(jié)果顯示,在肺臟中,IL-17D主要由CD45-細胞表達;IL-17D在B16轉(zhuǎn)移性肺癌、皮膚癌、腸癌組織中的蛋白及m RNA表達均顯著下降(P0.05),在肺癌組織中的降低尤為明顯。另外,在B16轉(zhuǎn)移性肺癌組織中,IL-17D的m RNA表達水平隨時間呈遞減趨勢。2.肺臟中IL-17D的細胞來源。流式細胞術結(jié)果顯示,肺臟中CD45-IL-17D+的細胞中有40~80%是成纖維細胞(CD45-CD140a+)。另外,流式細胞胞內(nèi)外因子雙染法表明,肺臟成纖維細胞分泌的IL-17D在小鼠B16轉(zhuǎn)移性肺癌中顯著減少(P0.05)。3.B16轉(zhuǎn)移性肺癌局域浸潤淋巴細胞的表達模式。流式結(jié)果顯示,B16轉(zhuǎn)移性肺癌局部浸潤的CD3+T、CD8+T及NK細胞比例均顯著降低(P0.05),CD4+T無明顯變化;另外,NK細胞分泌的IFN-γ明顯減少(P0.05),而CD4+T、CD8+T細胞分泌IFN-γ無顯著變化。4.B16轉(zhuǎn)移性肺癌局域趨化因子及細胞因子分泌模式。肺臟成纖維細胞可分泌CXCL9、CXCL10、GM-CSF、IL-1β、TNFa和IL-23等多種因子,不但可以募集多種淋巴細胞的局部聚集,也影響原位淋巴細胞的表型和功能。q-PCR結(jié)果顯示,與正常對照小鼠相比,B16轉(zhuǎn)移性肺癌小鼠肺臟CXCL9、CXCL10的m RNA表達水平顯著下降(P0.05);S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF的m RNA表達均明顯下調(diào)(P0.05)。5.IL-17D抑制小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移。與PBS對照組相比,IL-17D滴鼻小鼠的肺臟腫瘤克隆數(shù)顯著下降(P0.05),并且伴隨肺臟局部浸潤CD8+T及NK細胞比例顯著增加(P0.05);另外,q-PCR結(jié)果顯示,IL-17D滴鼻小鼠的肺臟CXCL9、CXCL10、GM-CSF的m RNA表達水平明顯上升(P0.05),表明IL-17D可能是通過CXCL9、CXCL10趨化NK、CD8+T細胞至腫瘤局部,發(fā)揮抗腫瘤作用。6.腫瘤細胞抑制原代肺成纖維細胞IL-17D表達。B16腫瘤細胞與小鼠肺成纖維細胞共培養(yǎng)后收集細胞做RT-PCR,結(jié)果顯示,B16細胞可明顯抑制成纖維細胞IL-17D及趨化因子CXCL9、CXCL10的m RNA表達,且抑制效果與共培養(yǎng)比例呈正相關。另外人肺癌A549細胞培養(yǎng)上清可顯著抑制原代人胚胎肺成纖維細胞的增殖及IL-17D及CXCL9、CXCL10的m RNA表達,且抑制效果呈濃度依賴性。7.IL-17D對肺成纖維細胞體外趨化NK及CD8+T細胞的影響。流式細胞術顯示,與對照組(下層不接種細胞)相比,肺成纖維細胞可有效趨化肺臟、外周血及脾臟NK及CD8+T細胞進入下室。經(jīng)LLC上清刺激培養(yǎng)后,肺成纖維細胞對NK及CD8+T細胞的趨化作用顯著減弱(P0.05),若同時加入r m IL-17D刺激,則肺成纖維細胞對NK及CD8+T細胞的趨化作用明顯增加(P0.05),且與r m IL-17D劑量成正相關。另外,通過收集下室肺成纖維細胞做RT-PCR,結(jié)果顯示,經(jīng)LLC上清刺激后,肺成纖維細胞IL-17D、CXCL10及IL-15的m RNA表達水平顯著下調(diào),若同時加入r m IL-17D刺激,則肺成纖維細胞IL-17D、CXCL10及IL-15的m RNA表達水平明顯上調(diào)。結(jié)論:1.肺臟成纖維細胞分泌的IL-17D在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用:肺癌中成纖維細胞分泌IL-17D減少可引起趨化因子CXCL9、CXCL10及細胞因子IL-12、IL-15、GM-CSF表達降低,進而導致腫瘤局域募集的NK、CD8+T細胞數(shù)量減少、功能減弱,從而促進腫瘤肺轉(zhuǎn)移。2.成纖維細胞分泌的IL-17D通過CXCL9、CXCL10趨化NK細胞及CD8+T細胞至腫瘤局部,發(fā)揮抗腫瘤作用。研究背景:根據(jù)聯(lián)合國原子輻射影響問題科學委員會近期發(fā)表的一份報告指出,在全世界人口遭受的由自然或人為因素導致的各種輻射中,有接近20%來自醫(yī)療輻射。輻射(irradiation,IR)對放療病人及從業(yè)人員的損傷已引起社會廣泛關注,其通過產(chǎn)生反應氧和自由基,可造成機體活細胞尤其是免疫細胞形態(tài)與功能的損傷。臨床腫瘤放療產(chǎn)生的副作用,在免疫系統(tǒng)可表現(xiàn)為具有免疫抑制作用或促腫瘤作用的一些細胞亞群如Treg、Th17、MDSC等的累積。T細胞是高度異質(zhì)性的細胞群體。其中,CD4+初始T細胞在不同細胞因子微環(huán)境下,可以向不同細胞亞群如Th1、Th2、Th17及Treg等分化,從而介導不同免疫功能。這些細胞亞群之間相互促進、相互抑制,共同打造機體有效的抗腫瘤免疫微環(huán)境,因此,輻射損傷后T細胞亞群的免疫重建能力直接關系到機體的抗腫瘤作用。肉桂(cinnamon)具有滋養(yǎng)肝腎的作用,其作為香料和調(diào)味品在全世界范圍內(nèi)得到廣泛應用。作為組方藥,肉桂常用于治療糖尿病、關節(jié)炎、腫瘤等,而其在輻射后靶向T細胞的作用尚不明確。研究目的:1.觀察小劑量全身輻射損傷后小鼠T細胞亞群免疫重建的特點,為臨床如何利用機體自身的免疫修復能力科學選擇腫瘤放療頻率和時間提供實驗依據(jù)。2.輻射損傷后免疫重建受損會削弱機體的抗腫瘤免疫,本研究探討輻射后機體免疫重建受損對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及肉桂的調(diào)節(jié)作用,為臨床腫瘤放療病人藥物輔助治療提供基礎研究數(shù)據(jù)。研究方法:1.肉桂水提液的制備:采用傳統(tǒng)法水煎、醇沉、回收乙醇,制備成肉桂水提液。2.輻射損傷模型及肉桂制劑的干預方法:采用X射線2.5 Gy單次全身照射建立小鼠輻射損傷模型;在小鼠于飲用水中給予0.1%水提液建立肉桂處理模型。3.腫瘤模型的建立:采用B16細胞2×105個尾靜脈注射,建立轉(zhuǎn)移性肺癌模型。4.采用血細胞分析儀檢測小鼠血常規(guī)變化。5.流式細胞術檢測小鼠外周血、脾臟中CD3+T、CD4+T、CD8+T變化以及脾臟中CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的表達水平。6.胞內(nèi)外染色法分析小鼠脾臟及肺臟中CD4+T細胞各亞群Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17A+)、Treg(CD4+CD25+foxp3+)及IFN-γ+IL-17A+Th17細胞的比例變化。7.逆轉(zhuǎn)錄PCR技術檢測小鼠脾臟中CD4+T細胞各亞群特征性核轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3的m RNA水平的變化;RT-PCR技術檢測IL-12、IL-15、IL-23的m RNA水平變化。8.利用解剖顯微鏡觀察輻射前后及肉桂處理前后小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移克隆數(shù)變化。研究結(jié)果:1.淋巴細胞是應對輻射最敏感的細胞群體。在血常規(guī)的幾項指標中,淋巴細胞比例在輻射后第3、5天顯著下降(P0.05),在輻射后第5天開始恢復,在10天較第3天顯著增加(P0.05),開始恢復。單核細胞、粒細胞、紅細胞、血紅蛋白無顯著變化。2.輻射損傷后T細胞亞群變化特點。脾臟和外周血中的CD3+T細胞在淋巴細胞中的比例在第3、5天顯著降低(P0.05),在第10天開始恢復。CD3+T細胞的絕對數(shù)也發(fā)生同步改變。CD4+T細胞比例在第5天降到最低,在第8天開始恢復。CD8+T細胞比例和絕對數(shù)在第3天降至最低,在第5天已開始恢復,CD4+T細胞的免疫重建較CD8+T細胞延遲。另外,共刺激分子CD80、CD86及MHC-II水平及IL-12、IL-15、IL-23的m RNA表達在輻射后第5天顯著降低(P0.05),在輻射后第10天明顯增加(P0.05)。3.輻射損傷后CD4+T細胞各亞群變化特點。通過檢測脾臟中Tc1、Th1、Th2、Th17、Treg在T細胞中所占比例,進一步觀察了CD4+T細胞細胞因子分泌模式,結(jié)果顯示,在輻射后第10天,伴隨著CD4+T細胞總體水平的恢復,CD4+T細胞各亞群仍處于失衡狀態(tài),表現(xiàn)為:與對照組相比,Tc1、Th1亞群比例和絕對數(shù)顯著下降(P0.05),Th2、Th17、Treg亞群比例則明顯增加(P0.05)。具有抗腫瘤作用的IFNγ+IL-17A+Th17亞群比例顯著降低(P0.05)。4.肉桂調(diào)節(jié)輻射損傷后T細胞亞群免疫重建作用。與輻射模型組相比,肉桂處理小鼠的Th1、Tc1亞群比例及細胞數(shù)顯著上升(P0.05),Th17亞群比例明顯降低(P0.05),Treg細胞比例及絕對數(shù)均顯著下降(P0.05),Th2亞群無明顯變化。IFNγ+IL-17A+Th17亞群比例明顯增加(P0.05)。5.CD4+T細胞各亞群的特征性核轉(zhuǎn)錄因子變化。與對照組相比,照射后第10天小鼠T-bet的m RNA表達水平顯著下調(diào)(P0.05),GATA3、RORγT、Foxp3的m RNA表達水平則明顯上調(diào)(P0.05);與照射小鼠相比,肉桂處理小鼠T-bet的m RNA表達水平顯著增高(P0.05),Foxp3的m RNA表達水平則明顯降低(P0.05),GATA3則無顯著變化。這些變化與CD4+T細胞各亞群變化一致。6.肉桂加強了輻射損傷小鼠對抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。與B16小鼠相比,輻射后B16小鼠肺部的腫瘤克隆數(shù)顯著增加(P0.05);與輻射后B16小鼠相比,肉桂處理的輻射后B16小鼠肺部腫瘤克隆數(shù)明顯降低(P0.05)。7.輻射損傷前后肺部腫瘤局域T細胞亞群變化特征。與正常B16小鼠相比,輻射損傷后B16小鼠肺臟腫瘤浸潤Th1、Tc1比例顯著降低(P0.05),肉桂處理后,Th1、Tc1比例顯著增加(P0.05),這些變化也與腫瘤發(fā)展一致。結(jié)論:1.T淋巴細胞在輻射后第3-5天降至最低,在第10天恢復至正常水平,其中CD4+T細胞免疫重建較CD8+T細胞延遲。2.小劑量全身輻射損傷后T細胞亞群免疫重建特點表現(xiàn)為Th1的劣勢,及Th17、Treg的相對優(yōu)勢,這種狀態(tài)促進了腫瘤轉(zhuǎn)移。肉桂通過促進Th1亞群增殖,抑制Th17及Treg亞群,從而有效逆轉(zhuǎn)輻射損傷后T細胞亞群失衡,從而加強抗腫瘤免疫。
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 Priyanka Pahan;Kalipada Pahan;;Can cinnamon bring aroma in Parkinson's disease treatment?[J];Neural Regeneration Research;2015年01期

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本文編號：1201678