本文關(guān)鍵詞：基于超抗原SEB的小鼠肺癌免疫基因治療

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【摘要】：研究背景與目的:肺癌已成為人類頭號癌癥殺手。我國肺癌的患病率和死亡率仍在不斷攀升。在過去幾十年,隨著手術(shù)技術(shù)的進步,放化療治療,針對表皮生長因子(epithelial growth factor receptor,EGFR)突變的絡(luò)氨酸激酶抑制劑的使用,肺癌的治療效果有一定改善,但其總的5年生存率仍小于15%。因此,探索肺癌治療新方法仍具有迫切的現(xiàn)實意義。肺癌免疫基因治療是近年來研究的熱點之一。腫瘤免疫基因治療的重要策略之一,是通過核酸分子克隆技術(shù),將特定外源性抗原基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞,使其表達外源性抗原,激活機體免疫系統(tǒng),殺傷腫瘤細胞。超抗原是由細菌、病毒、寄生蟲等分泌一類小分子蛋白質(zhì),微量抗原就能強烈激活免疫系統(tǒng),促進免疫效應(yīng)細胞的增殖,同時釋放免疫細胞因子。葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣泛的超抗原之一,其有多達幾十種亞型,諸如SEA、SEB、SEC等,SEB為最常見的亞型之一。SEs作為一類細菌性外毒素,是葡萄球菌感染導(dǎo)致的各種炎性癥狀的主要原因,這些癥狀包括發(fā)熱、腹瀉以至感染性休克。不過,近年來也有研究顯示,因其強抗原性,SEs可能在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮作用。然而,也有研究,SEs的強抗原性可以引入腫瘤細胞中并使其表達。本研究將構(gòu)建SEB基因表達載體,并研究其對Lewis肺癌荷瘤小鼠的治療作用。從而探討以SEB為目的基因的肺癌免疫基因治療的可行性和具體方法。方法:1.以Gen Bank中SEB基因c DNA序列為模板,密碼子優(yōu)化后,通過化學(xué)合成的方法獲得目的基因SEB序列,同時設(shè)計用于PCR擴增SEB基因的引物,正向引物序列為:5,-AAGTATCTAGAGATGCCACCATGTACAACAGACTCTTCGTCAGCC-3,;反向引物::5'-GCCGAGGATCCTCACTTCTTCTTAGTTGTCAGGTATA-3。引物的5,端分別設(shè)計有Xba I(TCTAGA)、Bam HI(GGATCC)酶切位點。2.通過核酸分子克隆技術(shù)將SEB基因克隆到質(zhì)粒PCDH-CMV-GFP中,構(gòu)建成SEB表達質(zhì)粒PCDH-SEB-GFP;并用測序方法和酶切方法進行鑒定。3.用脂質(zhì)體將構(gòu)建的PCDH-SEB-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠Lewis肺癌細胞,并用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中SEB蛋白的表達情況。4.將小鼠Lewis肺癌細胞接種到C57小鼠右側(cè)腋下(3×106個細胞/只),當(dāng)腫瘤體積約為50mm3時,將小鼠分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,每組6只小鼠。實驗組小鼠瘤內(nèi)注射PCDH-SEB-GFP質(zhì)粒,陰性對照組瘤內(nèi)注射空載質(zhì)粒PCDH-CMV-GFP,空白對照組注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)。質(zhì)粒注射每3天一次,共3次,每次質(zhì)粒用量為20ug,脂質(zhì)體20ul,用無血清培養(yǎng)基調(diào)整至100ul。每2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑,計算瘤體體積,繪制腫瘤生長曲線,最后一次質(zhì)粒注射后2天,剝出眼球采血,并處死小鼠,完整剝離腫瘤塊,測量腫瘤長徑和短徑,據(jù)此計算瘤體體積,比較各組小鼠瘤體體積;用電子天平稱量腫瘤質(zhì)量,比較各組小鼠平均瘤重的差異。5.取各組小鼠腫瘤組織作常規(guī)HE染色,觀察腫瘤組織有無壞死,以及有無炎細胞浸潤;用免疫組化方法檢測腫瘤組織中SEB表達情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測各組小鼠血清中細胞因子γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的濃度。結(jié)果:1、本研究合成的SEB基因長度為801bp,通過瓊脂糖凝膠電泳、基因測序鑒定,基因大小及序列與預(yù)期結(jié)果完全一致。2、成功構(gòu)建SEB基因表達質(zhì)粒,測序和酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。3、用脂質(zhì)體方法將PCDH-SEB-GFP和PCDH-CMV-GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細胞,24小時后,部分細胞內(nèi)可見綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率約40%;Western blot實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PCDH-SEB-GFP質(zhì)粒的Lewis肺癌細胞中有SEB蛋白表達,而轉(zhuǎn)染空載體PCDH-CMV-GFP質(zhì)粒的Lewis肺癌細胞及空白組(未轉(zhuǎn)染)無SEB蛋白表達。4、成功構(gòu)建Lewis肺癌細胞C57小鼠腫瘤模型,小鼠成瘤率100%,成瘤期間小鼠無死亡。實驗組(瘤內(nèi)注射PCDH-SEB-GFP質(zhì)粒)小鼠平均瘤體體積、瘤體質(zhì)量小于對照組,空白組小鼠瘤體總體積、質(zhì)量明顯大于其余2組。5、HE染色顯示實驗組所有小鼠腫瘤剖面見出血、壞死區(qū),陰性對照組少數(shù)腫瘤可見灶性小壞死區(qū),空白組腫瘤無明顯壞死區(qū)域;實驗組和陰性對照組有炎性細胞浸潤,其中實驗組更明顯,空白對照組無明顯炎細胞浸潤;免疫組化實驗顯示,實驗組部分腫瘤細胞表達SEB,其余兩組腫瘤內(nèi)無表達SEB細胞;ELISA結(jié)果提示各組細胞因子水平無明顯差異。結(jié)論:1、通過質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,超抗原SEB原核細菌基因能在Lewis肺癌細胞中表達。2、超抗原SEB基因能抑制小鼠腫瘤生長。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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