本文關鍵詞：MiR-367-3p抑制TGF-β誘導的非小細胞肺癌上皮—間質轉化的作用機制

  更多相關文章： 非小細胞肺癌 TGF-β miR-367-3p ZEB2 上皮-間質轉化

【摘要】：背景與目的:目前來看肺癌仍是全球范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。調查數(shù)據(jù)顯示肺癌約占男性癌癥死亡率的28%及女性的26%,均居癌癥相關死亡率的首位。肺癌中又以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)最為多見,約占肺癌總數(shù)的85%。雖然近年來靶向治療的發(fā)展在一定程度上提高了非小細胞肺癌的治療效果,但五年生存率仍無明顯改善。影響NSCLC預后的最主要因素是復發(fā)和轉移,研究表明TGF-β在癌癥早期能抑制上皮細胞增殖起著抑癌作用,而在晚期則促進腫瘤生長和轉移;體內TGF-β含量較高的患者預后較差。因此對NSCLC侵襲、轉移機制的研究已成為當前國內外研究的熱點。MicroRNA發(fā)揮基因表達調控作用通常是通過與特定的靶基因3'UTR種子序列完全或不完全互補配對來實現(xiàn)基因沉默或降解的。已經(jīng)有許多研究表明在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中檢測到了多種microRNAs表達的改變。我們通過生物信息學網(wǎng)站預測顯示多個microRNAs可以靶向ZEB2的3'UTR區(qū)域的不同種子序列。本研究旨在探討NSCLC中ZEB2異常表達的microRNA調控機制,為NSCLC的早期診斷和治療提供實驗依據(jù)。方法:(1)生物信息學軟件預測分析能夠靶向ZEB2的3'UTR區(qū)域的microRNAs,我們篩選到miR-367-3p。首先運用雙熒光素酶活性檢測實驗驗證miR-367-3p是否與ZEB2 3'UTR區(qū)域的種子序列直接結合,驗證mi R-367-3p對ZEB2的靶向作用。合成miR-367-3p mimics瞬時轉染A549和H226細胞,運用Real-Time PCR和Western Blot方法檢測轉染前后ZEB2 mRNA和蛋白表達變化。(2)Real-Time PCR方法分別檢測在人正常支氣管細胞HBE和6株NSCLC細胞以及20例淋巴結轉移、20例沒有淋巴結轉移和60對NSCLC組織樣本中miR-367-3p和ZEB2基因的mRNA表達水平。并且將20例淋巴結轉移、20例沒有淋巴結轉移的NSCLC組織中miR-367-3p和ZEB2基因做差異性表達對比分析,將60對NSCLC樣本組織中的miR-367-3p和ZEB2基因的表達作回歸分析,統(tǒng)計出NSCLC中ZEB2和miR-367-3p表達的相關性。(3)將miR-367-3p的模擬體mimics轉染至NSCLC細胞株A549和H226中,在加或不加TGF-β刺激下,運用Western Blot方法檢測TGF-β誘導的EMT分子marker:e-cadherin,n-cadherin,vimentin的蛋白表達情況。運用transwell細胞遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移及侵襲能力的變化。(4)將si-zeb2轉染到nsclc細胞株a549和h226細胞中將zeb2基因干擾,在加或不加tgf-β刺激下,運用westernblot方法檢測tgf-β誘導的emt分子marker:e-cadherin,n-cadherin,vimentin的蛋白表達情況。運用transwell細胞遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移及侵襲能力的變化。結果:(1)通過生物信息學軟件預測和在nsclc細胞中的dualluciferasereporterassay實驗可知mir-367-3p可以結合在zeb2基因的3'utr區(qū)。nsclc細胞株a549和h226瞬時轉染mir-367-3p模擬體mimics,zeb2基因的mrna和蛋白表達都顯著下降。因此可證明mir-367-3p下調zeb2基因的mrna和蛋白表達并且這種作用是通過mir-367-3p與zeb2基因的3'utr種子序列直接結合引起的。(2)與正常肺上皮細胞hbe相比nsclc細胞a549、95c、95d、h1299、h226、和ltep-α-2中zeb2mrna高表達,mir-367-3p低表達。相比于20例沒有淋巴結轉移的nsclc組織,在20例有遠端淋巴結轉移的nsclc組織中,zeb2基因明顯高表達但是mir-367-3p的表達沒有體現(xiàn)出差異性表達。在60對nsclc組織樣本中,我們通過癌組織比癌旁組織對zeb2和mir-367-3p的表達作回歸分析發(fā)現(xiàn)nsclc中兩者的表達之間是沒有明顯相關性的。(3)在nsclc細胞a549和h226中瞬轉mir-367-3pmimics過表達后,在加或不加tgf-β刺激下,由tgf-β誘導的emt分子marker中,e-cadherin蛋白表達上調、n-cadherin、vimentin蛋白表達下調。并且transwell實驗顯示mir-367-3pmimics過表達后a549和h226細胞的轉移與侵襲能力受到抑制。(4)在nsclc細胞a549和h226中干擾zeb2后,在加或不加tgf-β刺激下,由tgf-β誘導的emt分子marker中,e-cadherin蛋白表達上調、n-cadherin、vimentin蛋白表達下調。并且transwell實驗顯示干擾zeb2基因后a549和h226細胞的轉移與侵襲能力受到抑制。結論:nsclc中mir-367-3p能夠直接靶向zeb2的3'utr種子序列而沉默zeb2基因的表達。相比于hbe細胞,nsclc細胞中mir-367-3p低表達而zeb2基因高表達。nsclc患者組織中有淋巴結轉移的nsclc組織樣本中zeb2基因表達明顯高于沒有淋巴結轉移的nsclc組織樣本,但是mir-367-3p沒有在兩者之間體現(xiàn)差異性表達。進一步驗證mir-367-3p和zeb2在nsclc組織中表達的相關性發(fā)現(xiàn)兩者并沒有呈現(xiàn)出負相關性,可能原因第一是由于mir-367-3p的表達量在nsclc組織中太低,還有就是可能其他mirna或lncrna也參與了對zeb2和miR-367-3p的調控作用。但是,miR-367-3p可能是一種抑癌基因,在肺癌的發(fā)生于發(fā)展中,miR-367-3p參與調節(jié)TGF-β誘導的EMT過程中上游轉錄因子ZEB2的表達,在抑制TGF-β誘導的NSCLC細胞上皮-間質轉化過程中發(fā)揮重要作用。通過研究mi R-367-3p對ZEB2基因的抑制作用可能會有助于提高我們對NSCLC的致病機制的了解,進而對NSCLC的診斷和治療提供可靠的理論基礎。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1165204