本文關(guān)鍵詞：乳腺癌干細(xì)胞在三陰乳腺癌EMT發(fā)生和血管生成擬態(tài)形成中的作用

  更多相關(guān)文章： 腫瘤干細(xì)胞 三陰乳腺癌 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 血管生成擬態(tài)

【摘要】：研究背景和目的三陰乳腺癌是乳腺癌的特殊的分子類型,其特點(diǎn)為腫瘤中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)均不表達(dá),因缺乏有效的治療靶點(diǎn),三陰乳腺癌患者的預(yù)后很差。在最近的研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞在三陰乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[1,2]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)是存在于腫瘤細(xì)胞中的一種特殊的亞群細(xì)胞,腫瘤干細(xì)胞數(shù)量稀少,并且具有自我更新以及多向分化的能力,研究證實(shí)腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,并影響患者的預(yù)后[3-5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,腫瘤干細(xì)胞與腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生和血管生成擬態(tài)的形成存在密切的聯(lián)系[6]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是機(jī)體正常胚胎發(fā)育及腫瘤轉(zhuǎn)移中重要的過(guò)程;腫瘤血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是近年發(fā)現(xiàn)的特殊腫瘤血液微循環(huán)模式,VM不依賴內(nèi)皮細(xì)胞,其管腔由腫瘤細(xì)胞圍成,并可以在管腔中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞,VM和腫瘤的惡性程度以及轉(zhuǎn)移具有緊密的聯(lián)系。在本課題中我們通過(guò)研究腫瘤干細(xì)胞在三陰乳腺癌EMT的發(fā)生及VM形成中的機(jī)制,從而為三陰乳腺癌的治療尋找新的思路。研究方法一、研究人三陰乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞同VM的關(guān)系。收集天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院總醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并且隨訪資料完整的100例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理資料100例,以腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD24、VM相關(guān)蛋白VE-cadherin為指標(biāo),對(duì)乳腺癌病理組織切片行免疫組織化學(xué)染色,并進(jìn)行CD31/PAS雙重染色,觀察并分析含有腫瘤干細(xì)胞特異性指標(biāo)CD44+和CD24—表型的乳腺癌干細(xì)胞和患者年齡、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移狀況、預(yù)后、是否為三陰乳腺癌、VE-cadherin蛋白表達(dá)以及和VM的相關(guān)性。二、腫瘤干細(xì)胞對(duì)三陰乳腺癌EMT發(fā)生和VM形成影響的體外研究1)常規(guī)培養(yǎng)三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和非三陰乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,檢測(cè)MDA-MB-231和MCF-7在管道結(jié)構(gòu)形成能力、遷移和侵襲能力的差異,使用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的差異;運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1+和CD133+表型細(xì)胞的含量,并在MDA-MB-231細(xì)胞中分選出帶有ALDH1+及ALDH1-表型的細(xì)胞。下文分別將ALDH1+表型的MDA-MB-231細(xì)胞和ALDH1-表型的MDA-MB-231簡(jiǎn)稱為ALDH1+231和ALDH1-231。2)將分選出的ALDH1+231和ALDH1-231細(xì)胞進(jìn)行低吸附無(wú)血清成球培養(yǎng),觀察ALDH1+231和ALDH1-231細(xì)胞體外成球能力的差異。3)利用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察ALDH1+231及ALDH1-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力的差異。4)利用三維培養(yǎng)分析ALDH1+231及ALDH1-231細(xì)胞管道結(jié)構(gòu)形成能力的差異。5)利用Western blot檢測(cè)ALDH1+231及ALDH1-231細(xì)胞中ALDH1的表達(dá)和EMT相關(guān)蛋白Twist1,E-cadherin,VM相關(guān)蛋白VE-cadherin的表達(dá)差異。三、TA2小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞對(duì)EMT發(fā)生、VM形成及生物學(xué)行為的影響1)選取天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房培育的自發(fā)三陰乳腺癌TA2小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌組織,將腫瘤組織研磨成單細(xì)胞懸液,使用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤組織中具有腫瘤干細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物ALDH+和CD133+的腫瘤干細(xì)胞含量。2)在本部分實(shí)驗(yàn)中,使用ALDH1作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物分選后的乳腺癌細(xì)胞記為ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞,使用CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物分選后的乳腺癌細(xì)胞記為CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞。分別將分選后的ALDH1+及ALDH1-、CD133+及CD133-共4組腫瘤細(xì)胞按照不同細(xì)胞量接種于TA2小鼠,觀察腫瘤干細(xì)胞對(duì)TA2小鼠乳腺癌生物學(xué)行為的影響。3)將TA2小鼠腫瘤組織制成組織切片,進(jìn)行ALDH1、CD133、VE-cadherin、E-cadherin、Twsit1和endomucin/PAS雙重染色,觀察腫瘤干細(xì)胞對(duì)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Twsit1、VM形成相關(guān)蛋白VE-cadherin的影響以及對(duì)VM形成的作用。研究結(jié)果一、在三陰乳腺癌中CD44表達(dá)高于非三陰乳腺癌,CD44陽(yáng)性患者預(yù)后較差,CD44表達(dá)與VE-cadherin表達(dá)以及VM呈正相關(guān),CD24表達(dá)與VM呈負(fù)相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示:在100例乳腺癌病例中,包括CD44陽(yáng)性病例56例(56%),CD44陰性病例44例(44%),在三陰乳腺癌組織中CD44表達(dá)高于非三陰乳腺癌患者(c2=5.884,P=0.016),VM陽(yáng)性患者中CD44表達(dá)明顯升高(c2=3.89,P=0.049)。通過(guò)對(duì)TNM分期比較,在Ⅲ、Ⅳ期病人的癌組織中CD44表達(dá)比Ⅰ,Ⅱ期病人要高(c2=3.89,P=0.049),VEcaderin免疫組化結(jié)果顯示,CD44陽(yáng)性表達(dá)的病例中,VE-cadherin要高于CD44陰性表達(dá)病例(c2=4.127,P=0.042)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,CD44陽(yáng)性患者組比CD44陰性患者組的生存時(shí)間短(c2=4.307,P=0.038)。CD44的表達(dá)在患者年齡、分級(jí)、腫瘤大小、以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CD24陽(yáng)性病例占66例(66%),陰性病例占34例(34%),對(duì)比CD24陽(yáng)性和CD24陰性病例發(fā)現(xiàn),VM與CD24表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(c2=4.397,P=0.036),其他相關(guān)數(shù)據(jù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞含量高于非三陰乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的含量。ALDH1+231細(xì)胞在體外成球能力、侵襲和遷移能力、形成管道的能力均高于ALDH1-231的細(xì)胞,并且細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)較高。1)三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的體外形成管道、遷移、侵襲能力以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)高于非三陰乳腺癌細(xì)胞MCF-7。2)流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果證實(shí),在MDA-MB-231中ALDH1+表型細(xì)胞的表達(dá)占26.87%,CD133+表型細(xì)胞占8.75%。MCF-7細(xì)胞系中ALDH1+表型細(xì)胞占3.4%,CD133+表型細(xì)胞占1.27%。3)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與ALDH1-231細(xì)胞相比,ALDH1+231的細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。4)三維培養(yǎng)結(jié)果顯示,ALDH1+231細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)形成能力明顯強(qiáng)于ALDH1-231細(xì)胞。5)Westernblot結(jié)果顯示,ALDH1+231細(xì)胞的VE-cadherin蛋白,Twist1蛋白表達(dá)高于ALDH1-231組,E-cadherin蛋白表達(dá)低于ALDH1-231組。三、TA2高轉(zhuǎn)移三陰乳腺癌組織中存在腫瘤干細(xì)胞,ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)能力,并影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)并促進(jìn)VM的形成。1)在TA2高轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中ALDH1+細(xì)胞占31.2%,CD133+細(xì)胞占6.5%。2)ALDH1+組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯高于ALDH1-組小鼠。CD133+組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯高于CD133-組小鼠。3)免疫組化染色后發(fā)現(xiàn),相對(duì)于ALDH-組小鼠,ALDH1+組小鼠ALDH1表達(dá)升高,同時(shí)VE-cadherin,Twist1表達(dá)也升高,而E-cadherin表達(dá)降低。CD133+組小鼠對(duì)比CD133-組,CD133表達(dá)升高,同時(shí)VE-cadherin和Twist1表達(dá)升高,E-cadherin表達(dá)降低。4)endomucin/PAS雙重染色結(jié)果顯示,ALDH1+組小鼠中VM陽(yáng)性率明顯高于ALDH1-組。研究結(jié)論1、人三陰乳腺癌中CD44的表達(dá)高于非三陰乳腺癌,CD44陽(yáng)性患者預(yù)后更差,CD44的表達(dá)與乳腺癌中VM、VE-cadherin表達(dá)和TNM分期呈正相關(guān),CD24的表達(dá)同VM呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明三陰乳腺癌其惡性程度高、患者預(yù)后差可能與乳腺癌干細(xì)胞的高含量有關(guān),乳腺癌干細(xì)胞可能參與了腫瘤VM的形成。2、三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中的ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細(xì)胞含量要高于非三陰乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的含量。相對(duì)于ALDH1-231細(xì)胞,ALDH1+231的遷移、侵襲和形成管道結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng),EMT相關(guān)蛋白表達(dá)升高,說(shuō)明ALDH1+表型的乳腺癌干細(xì)胞有更強(qiáng)的VM形成能力,并且促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。3、在TA2高轉(zhuǎn)移乳腺癌中ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細(xì)胞在TA2小鼠中成瘤能力更強(qiáng),并影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)三陰乳腺癌中VM的形成。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
，

本文編號(hào)：1164075