發(fā)布時間：2017-10-31 04:12

  本文關鍵詞：C-myb原癌基因中G-四鏈體和i-motif結構的形成、性質和識別

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【摘要】：人類端粒和原癌基因啟動子區(qū)存在大量的重復序列,這些序列能夠折疊成特殊的二級結構,存在的富G序列折疊成的二級結構被稱作G-四鏈體,體外實驗證明在生理條件的溫度、pH、離子強度下,這些序列能夠形成穩(wěn)定的G-四鏈體結構,并且在細胞環(huán)境中運用適當?shù)呐潴w證明了該結構存在于哺乳動物細胞中,一些與G-四鏈體結構結合的的配體也被用來抑制端粒并控制原癌基因表達。基因組DNA中,富G序列對應的互補序列是富C序列,這些序列折疊形成的二級結構被稱作i-motif,體外實驗證明這些序列在生理條件的溫度、離子強度和pH低于7的環(huán)境中能形成穩(wěn)定的i-motif結構,其在體內細胞的存在性和作為細胞生物學化學介入靶標的可能性目前尚不確定,但是能夠選擇性與富C序列結合的蛋白質分離物仍激勵了人們對i-motif結構生物作用的研究,因此,i-motif結構依然具有重要的研究意義。本文選取了C-myb原癌基因啟動子區(qū)或啟動子區(qū)附近富G序列和富C序列,通過電噴霧質譜(ESI-MS)和圓二色譜(CD)實驗,探索了這些序列形成的G-四鏈體和i-motif結構及性質,并篩選出能與結構結合的配體。本實驗的研究內容和結果如下：1.選取C-myb原癌基因啟動子區(qū)上游富G序列S1為靶點,加上兩端增加兩個堿基的序列S2及其互補富C序列S3為研究對象,首先利用ESI-MS證明了S1和S2在NH4OAc溶液中形成了G-四鏈體結構,并發(fā)現(xiàn)S1在高濃度NH4OAc中能形成二聚體結構而S2不會；進一步用CD實驗證明了S1和S2在不同濃度的NH4OAc和KCl溶液中形成了平行鏈構型的G-四鏈體；用ESI-MS篩選出了對S1G-四鏈體有高親和力和選擇性的小分子配體馬錢子堿,該分子在含有短鏈雙螺旋和基因組雙螺旋結構的情況下依然對S1 G-四鏈體具有選擇性;最后利用CD升溫,質譜升溫和二級串聯(lián)質譜實驗證明小分子的結合對結構穩(wěn)定性具有促進作用。2.選取C-myb原癌基因啟動子區(qū)下游富G序列S4為靶點,首先利用ESI-MS證明了S4在NH4OAc溶液中形成了G-四鏈體結構,并用CD實驗驗證了質譜的結論,發(fā)現(xiàn)S4在不同濃度的NH4OAc和KC1溶液中形成了平行／反平行鏈混合的G-四鏈體構型；接下來利用CD實驗研究了不同濃度NH4+、K+和甲醇對G-四鏈體結構的影響,發(fā)現(xiàn)NH4+、K+促進溶液中G-四鏈體結構含量增加,甲醇含量增加促進結構中平行鏈結構轉化為反平行結構；接下來篩選出對S4 G-四鏈體有高親和力和選擇性的小分子原阿片堿,并利用二級串聯(lián)質譜證明了小分子的結合能促進結構的穩(wěn)定。3.選取C-myb原癌基因啟動子區(qū)富C序列S5和S6為靶點,加上S6的互補序列S7為研究對象,首先利用ESI-MS和CD實驗證明了pH4.5的酸性溶液條件下序列能形成i-motif結構；探索了溶液條件改變對結構的影響,發(fā)現(xiàn)NH4OAc濃度和CH3OH含量不影響結構,但是能改變質譜的信噪比,對結構的主要影響因素是溶液的pH及擁擠條件；研究了兩條序列在一系列不同pH的PBS溶液中的CD譜圖和升溫譜圖發(fā)現(xiàn),酸性條件不僅能夠促進i-motif結構的形成也有利于提高結構的穩(wěn)定性；利用ESI-MS篩選了對結構有親和力的小分子防己諾林堿,并研究了不同溶液環(huán)境下S6與它的互補鏈的競爭實驗。
【關鍵詞】：電噴霧質譜 G-四鏈體 i-motif 天然產(chǎn)物小分子 特異性識別
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 緒論10-27
• 1.1 引言10
• 1.2 G-四鏈體和i-motif結構的生物學意義10-16
• 1.2.1 G-四鏈體和i-motif的結構10-12
• 1.2.2 G-四鏈體和i-motif結構形成和穩(wěn)定性的影響因素12-13
• 1.2.3 G-四鏈體結構在生物體內的存在及功能13-16
• 1.3 G-四鏈體與i-motif的配體分子16-23
• 1.3.1 G-四鏈體的配體分子16-22
• 1.3.1.1 π-π堆積作用分子16-20
• 1.3.1.1.1 吖啶衍生物16-17
• 1.3.1.1.2 卟啉衍生物及其類似物17-18
• 1.3.1.1.3 喹啉衍生物18-19
• 1.3.1.1.4 異喹啉及其衍生物19
• 1.3.1.1.5 端粒霉素及其類似物19-20
• 1.3.1.2 溝區(qū)/loop區(qū)作用分子(偏端霉素A及其衍生物)20-21
• 1.3.1.3 與G-四分體中心結合的分子(部分蒽醌及其類似物)21-22
• 1.3.2 i-motif結構的配體分子22-23
• 1.4 C-myb基因的生物功能23-24
• 1.5 G-四鏈體的研究手段24-26
• 1.6 本課題的基本思路和目的26-27
• 第2章 C-myb中S1 G-四鏈體的形成、性質及與馬錢子堿的結合27-41
• 2.1 引言27
• 2.2 實驗儀器與試劑27-28
• 2.2.1 實驗儀器27
• 2.2.2 實驗試劑27-28
• 2.3 實驗方法28-29
• 2.3.1 各儲備液的配制28
• 2.3.2 電噴霧質譜溶液配制及實驗方法28
• 2.3.3 圓二色譜溶液配制及實驗方法28-29
• 2.4 結果與討論29-40
• 2.4.1 G-四鏈體結構的形成及性質29-31
• 2.4.2 S2末端堿基對G-四鏈體結構的影響31-33
• 2.4.3 幾種生物堿分子與G-四鏈體的結合親和力33-35
• 2.4.4 馬錢子堿與G-四鏈體的結合選擇性35-37
• 2.4.5 G-四鏈體和雙螺旋結構與馬錢子堿結合的競爭實驗37-38
• 2.4.6 G-四鏈體和與馬錢子堿結合的復合物的熱穩(wěn)定性38-40
• 2.5 結論40-41
• 第3章 C-myb中S4 G-四鏈體的形成、性質及與原阿片堿的結合41-53
• 3.1 引言41
• 3.2 實驗儀器與試劑41-42
• 3.2.1 實驗儀器41-42
• 3.2.2 實驗試劑42
• 3.3 實驗方法42-43
• 3.3.1 各儲備液的配制42
• 3.3.2 電噴霧質譜溶液配制及實驗方法42
• 3.3.3 圓二色譜溶液配制及實驗方法42-43
• 3.4 結果與討論43-52
• 3.4.1 C-myb基因中G-四鏈體結構的形成43-44
• 3.4.2 影響G-四鏈體結構和穩(wěn)定性的因素44-46
• 3.4.3 S4與小分子原阿片堿的結合46-47
• 3.4.4 小分子原阿片堿與S4 G-四鏈體結合的選擇性47-49
• 3.4.5 結合小分子后對G-四鏈體結構及穩(wěn)定性的影響49-52
• 3.5 結論52-53
• 第4章 C-myb啟動子區(qū)i-motif結構的形成、性質和識別53-67
• 4.1 引言53-54
• 4.2 實驗儀器與試劑54
• 4.2.1 實驗儀器54
• 4.2.2 實驗試劑54
• 4.3 實驗方法54-55
• 4.3.1 各儲備液的配制54
• 4.3.2 電噴霧質譜溶液的配制及實驗方法54-55
• 4.3.3 圓二色譜溶液的配制及實驗方法55
• 4.4 結果與討論55-66
• 4.4.1 C-myb基因中富C序列的i-motif結構的形成55-56
• 4.4.2 影響i-motif結構形成的因素56-63
• 4.4.3 S6序列形成的i-motif結構的穩(wěn)定性63-64
• 4.4.4 i-motif結構與小分子的結合64-65
• 4.4.5 富C鏈與其互補鏈在不同溶液中形成的結構65-66
• 4.5 結論66-67
• 參考文獻67-79
• 攻讀碩士期間的主要科研成果79-80
• 致謝80

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本文編號：1120715