本文關(guān)鍵詞：妊娠期乳腺癌差異基因的篩選及FBXW7在乳腺癌中的功能研究

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【摘要】：乳腺癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率居女性常見腫瘤首位。隨著我國經(jīng)濟的不斷發(fā)展,以及女性生活方式的轉(zhuǎn)變,我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,在發(fā)病群體中也呈現(xiàn)出年輕化趨勢。誘發(fā)乳腺癌的因素有多種,BMI值、乳腺癌家族史、初潮年齡、絕經(jīng)年齡以及生活壓力、生活習慣等都與乳腺癌的發(fā)病危險性相關(guān)。隨著分子生物學和基因組學的不斷深入發(fā)展,人們認識到乳腺癌的發(fā)生與基因的突變密切相關(guān),在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中涉及了多種基因改變。隨著基因在乳腺癌發(fā)病機制中的作用的不斷深入研究,人們急切尋找可以有效降低乳腺癌發(fā)病率的相關(guān)基因,為早期診斷乳腺癌和治療乳腺癌提供有效的途徑。隨之產(chǎn)生的基因治療也逐漸成為治療乳腺癌的重要方法,如癌基因和抑癌基因治療方法,自殺基因治療方法和免疫基因治療方法,都是基于人們對乳腺癌相關(guān)基因的深入了解。加以傳統(tǒng)的手術(shù)以及放射治療、化療,提高了乳腺癌的治療成功率。因此,研究基因在乳腺癌中的致病機制具有重要意義。在人類基因組研究的推動下,基因組學得到了快速發(fā)展。隨之產(chǎn)生的基因芯片技術(shù)也在基因組學領(lǐng)域被廣泛應用。應用基因芯片技術(shù)可快速高效檢測組織或細胞中的基因表達特點,從而發(fā)現(xiàn)疾病中基因的差異表達情況,在腫瘤中的應用尤為常見�；蛐酒陌l(fā)展使基因功能研究也迅速發(fā)展,產(chǎn)生了大量的基因芯片信息,有待研究者們進一步的深入挖掘其深層意義。妊娠期乳腺癌是乳腺癌中的一種特殊類型,原發(fā)性乳腺癌確診時間在妊娠期或哺乳期或產(chǎn)后一年內(nèi)可成為妊娠期乳腺癌。在本研究中,我們利用生物信息數(shù)據(jù)庫,從現(xiàn)有的妊娠期乳腺癌基因芯片研究成果中搜索相關(guān)的表達譜基因芯片數(shù)據(jù)集,并篩選了在妊娠期乳腺癌與正常組織當中差異表達的基因,再通過生物信息學研究工具預測這些差異基因可能涉及的生物功能以及信號傳導通路。結(jié)合文獻檢索,最后篩選出一個可能與乳腺癌相關(guān)性較強的基因FBXW7作為下一步體外細胞實驗的目標。FBXW7基因?qū)儆诘鞍酌阁w系統(tǒng)的組成成員,是泛素SCF連接酶的組成蛋白。參與蛋白酶體系統(tǒng)地免疫調(diào)控、細胞代謝調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)到等多種重要的調(diào)控過程。研究表明,FBXW7基因在肝癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤以及胃癌中與其癌旁組織都存在不同程度的表達差異,并影響了細胞或組織的侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控,細胞的周期調(diào)控和機體的免疫調(diào)控等重要生物學過程,在多種腫瘤疾病中有著重要的作用。為進一步探索FBXW7對乳腺癌的影響和作用機制,本研究采用FBXW7高表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MCF-7,并通過CCK8, transwell實驗檢測細胞增殖和遷移、侵襲能力,流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡的變化。從而從細胞水平闡明FBXW7對乳腺癌細胞的生物學作用。研究方法：1.妊娠相關(guān)性乳腺癌芯片數(shù)據(jù)從美國國立生物信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫GEO中下載。在GEO Datasets數(shù)據(jù)庫搜索中以Pregnancy Associated Breast Cancer為檢索詞,查找并下載數(shù)據(jù)集。將數(shù)據(jù)集導入Qlucore Omics Explorer 3.0軟件,對芯片數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。對數(shù)據(jù)信息進行有效過濾,篩選出表達相對于正常組上調(diào)或下調(diào)的差異基因。2.在生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID在線網(wǎng)站中將篩選出的差異上調(diào)或下調(diào)表達基因?qū)?選擇DAVID軟件中的基因功能注釋,對這些差異基因分別進行生物學過程、分子功能、細胞組成以及生物學信號通路分析。3.結(jié)合文獻,篩選出與乳腺癌相關(guān)性較大的基因做后續(xù)研究。對篩選出的基因使用PredictProtein在線網(wǎng)站輸入基因的氨基酸序列,選擇功能預測欄目預測該基因的分子功能和生物學進程。4.構(gòu)建FBXW7過表達質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞作為實驗組(FBXW7),同時空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為陰性對照組(NC),未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞作為空白對照組(Control)。qRT-PCR和WB實驗驗證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率以及FBXW7 mRNA和蛋白在MCF-7中的表達。MCF.7細胞轉(zhuǎn)染FBXW7過表達質(zhì)粒后,CCK8實驗檢測細胞的增值活性；transwell實驗檢測細胞的遷移能力和侵襲能力；流式細胞儀檢測細胞的周期分布和凋亡情況。討論FBXW7過表達對MCF.7細胞的生物學行為影響。研究結(jié)果：1.妊娠相關(guān)性乳腺癌差異基因的篩選在GEO Datasets數(shù)據(jù)庫搜索中以Pregnancy Associated Breast Cancer為檢索詞,搜索到數(shù)據(jù)集GSE31192。Qlucore Omics Explorer 3.0軟件對數(shù)據(jù)集進行差異表達基因的篩選,共篩選出差異表達基因148個,其中乳腺癌細胞中高表達基因有24個,低表達基因有124個。2.妊娠相關(guān)性乳腺癌差異基因的生物信息學分析將篩選出的148個差異表達基因上傳至DANID,進行基因的功能注釋和信號傳導通路分析,結(jié)果表明這些差異基因在功能上主要聚類于細胞磷酸鹽代謝過程、細胞骨架蛋白結(jié)合、細胞分化、有絲分裂周期、血管發(fā)育、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性,聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控,胞膜囊泡組成等。差異基因所涉及的KEGG通路主要是粘著斑信號通路、血管平滑肌細胞收縮信號通路、調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架通路、黑色素瘤疾病通路、MAPK信號通路和細胞外基質(zhì)受體相互作用等信號通路。3.選定差異基因并預測其功能根據(jù)妊娠相關(guān)性乳腺癌差異基因的生物信息學分析結(jié)果,查閱相關(guān)文獻,綜合評比篩選出FBXW7可能作用于乳腺癌的基因為下一步研究目標。PredictProtein在線網(wǎng)站預測FBXW7基因的分子功能和生物學進程。預測結(jié)果顯不,FBXW7分子功能主要涉及核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、周期蛋白結(jié)合和動力蛋白等的結(jié)合。FBXW7參與的生物學過程主要有細胞代謝過程、細胞周期的調(diào)節(jié)等。4.構(gòu)建FBXW7過表達重組質(zhì)粒并檢測其轉(zhuǎn)染效果構(gòu)建FBXW7過表達重組質(zhì)粒pEZ-M02-FBXW7后經(jīng)擴大培養(yǎng)并篩選陽性克隆,PCR鑒定與測序結(jié)果顯示,重組克隆與理論預測序列一致,FBXW7過表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將FBXW7過表達重組質(zhì)粒pEZ-M02-FBXW7轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞,qRT-PCR實驗和WB實驗結(jié)果表明,經(jīng)轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞實驗組(FBXW7)中FBXW7的mRNA水平以及FBXW7蛋白水平相較于陰性對照組(NC),空白對照組(Control)均有明顯提高。5. FBXW7過表達對MCF-7細胞的生物學行為影響(1)CCK8實驗檢測細胞的增值活性。FBXW7過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞后,CCK8法檢測細胞的增殖情況。結(jié)果顯示,實驗組(FBXW7)的細胞在第36小時后OD值顯著低于陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)細胞,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)細胞間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)transwell實驗檢測細胞的遷移能力和侵襲能力。FBXW7過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后,tanswell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。細胞遷移結(jié)果顯示,實驗組(FBXW7)細胞遷移過小室膜的數(shù)目明顯少于陰性對照組(NC)和空白對照組(Control),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)：陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)細胞間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。細胞侵襲結(jié)果顯示,實驗組(FBXW7)細胞侵襲過小室膜的數(shù)目明顯少于陰性對照組(NC)和空白對照組(Control),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)細胞間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)流式細胞儀檢測細胞的周期分布。FBXW7過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后,FCM法檢測細胞周期分布情況。結(jié)果顯示,實驗組(FBXW7)細胞在G0/G1期所占百分比高于陰性對照組(NC)和空白對照組(Control),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)細胞的細胞周期分布間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。三組在G2/M期細胞所占百分比無統(tǒng)計學差異(P0.05)(4)流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。FBXW7過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后,FCM法檢測細胞凋亡情況。結(jié)果顯示,實驗組(FBXW7)細胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均高于陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；陰性對照組(NC)和空白對照組(Control)細胞間的細胞凋亡差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：利用生物信息學方法篩選到妊娠期乳腺癌患者與正常人群的差異基因共148個,其中表達上調(diào)24個,下調(diào)124個。這些基因參與了眾多與乳腺癌相關(guān)的生物學過程和信號通路,進一步進行文獻挖掘,篩選出與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因FBXW7。在對FBXW7基因功能的生物信息學分析基礎上,選取MCF-7乳腺癌細胞進行體外實驗。結(jié)果表明,FBXW7高表達可抑制乳腺癌細胞MCF-7增值、侵襲和遷移能力,并將細胞阻滯于GO/G1期,且能促進細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：乳腺腫瘤生物信息學 FBXW7 基因細胞增殖細胞轉(zhuǎn)移細胞凋亡
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9;R714.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一章 妊娠期乳腺癌相關(guān)基因的生物信息學分析20-36
• 1.1 材料與方法20-22
• 1.2 結(jié)果22-33
• 1.3 討論33-36
• 第二章 過表達FBXW7在乳腺癌細胞MCF-7中的功能研究36-63
• 2.1 材料與方法36-53
• 2.2 結(jié)果53-61
• 2.3 討論61-63
• 參考文獻63-69
• 英文縮略詞表69-71
• 攻讀學位期間成果71-72
• 致謝72-73

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本文編號：1096657