本文關(guān)鍵詞：MiR-335對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其與C-met靶向關(guān)系的驗(yàn)證

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【摘要】：Micro RNAs(mi RNAs)是一組內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)控因子,自發(fā)現(xiàn)至今,已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,部分mi RNAs的功能也逐漸得到確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)一部分異常表達(dá)的mi RNAs與乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系,其中mi R-335(micro RNA-335)表達(dá)缺失,提示預(yù)后不良。故本論文主要研究mi R-335對(duì)具有高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的生物學(xué)特性的影響及其與預(yù)測靶基因C-met靶向關(guān)系的驗(yàn)證。第一部分Mi R-335對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響目的:檢測mi R-335在乳腺癌細(xì)胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)以及在原發(fā)性乳腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)情況,進(jìn)一步研究mi R-335對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響。方法:采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測mi R-335在乳腺癌細(xì)胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)情況以及在原發(fā)性乳腺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞并將其分3組,分別為mi R-335組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。mi R-335組轉(zhuǎn)染mi R-335模擬物(has-mi R-335 mimics),陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列(negative control,NC),空白對(duì)照組細(xì)胞不行任何轉(zhuǎn)染。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)mi R-335對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)mi R-335對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)mi R-335對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。Western blot檢測MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:各乳腺癌細(xì)胞系中mi R-335表達(dá)水平均低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,MDA-MB-231細(xì)胞中最低(P0.01)。在隨機(jī)配對(duì)的10例原發(fā)性乳腺癌和10例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌標(biāo)本中,有7例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌中Mi R-335的表達(dá)低于對(duì)應(yīng)的原發(fā)性乳腺癌(P0.05)。過表達(dá)mi R-335對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、凋亡無明顯影響(P0.05),但能顯著抑制細(xì)胞的遷移能力(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示:mi R-335組MMP-2和MMP-9的蛋白的表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。結(jié)論:mi R-335在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中明顯低表達(dá),過表達(dá)mi R-335對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、凋亡無明顯影響卻抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。mi R-335可能通過下調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移。第二部分mi R-335與C-met靶向關(guān)系的驗(yàn)證目的:通過對(duì)Mi R-335與C-met靶向關(guān)系的驗(yàn)證進(jìn)一步研究其在乳腺癌細(xì)胞中具體作用機(jī)制。方法:Pic Tar(www.pictar.org)、Targetscan數(shù)據(jù)庫(www.target scan.org)預(yù)測mi R-335可能靶基因。熒光定量PCR及WB檢測mi R-335、c-Met在乳腺癌各細(xì)胞系和正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。構(gòu)建靶基因熒光報(bào)告載體,BT20、MDA-MB-231細(xì)胞共轉(zhuǎn)染野生型c-Met 3’UTR熒光素酶報(bào)告載體、突變型c-Met 3’UTR熒光素酶報(bào)告載體和mi R-335 mimics、mimics control,轉(zhuǎn)染后分別分為c-Met 3’UTR-wt組和c-Met 3’UTR-mut組并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測測定活性,BT20、MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染mi R-335 mimics、mimics control和m i R-335 ASO、ASO control后通過Western blot蛋白水平檢測評(píng)估cMet表達(dá)情況。結(jié)果:Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示C-Met的3’UTR區(qū)存在mi R-335的可能結(jié)合位點(diǎn)。熒光定量PCR及WB結(jié)果顯示:各乳腺癌細(xì)胞系中,c-Met在BT-20、MDA-MB-231細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平明顯升高,而在正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和其他乳腺癌細(xì)胞系中蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低。相反,mi R-335在BT-20、MDA-MB-231細(xì)胞中的RNA表達(dá)水平降低,在正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和其他乳腺癌細(xì)胞系中RNA表達(dá)水平升高。熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示:BT-20、MDA-MB-231細(xì)胞中,c-Met 3’UTR-wt組中轉(zhuǎn)染mi R-335 mimics的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染mimics control的細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯降低,c-Met 3’UTR-mut組中轉(zhuǎn)染mi R-335 mimics的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染mimics control的細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度無明顯變化。Western blot結(jié)果顯示mi R-335 mimics組較mimics control組蛋白表達(dá)水平降低,mi R-335 ASO組較ASO control組蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:乳腺癌各細(xì)胞系中mi R-335 m RNA水平表達(dá)和c-Met蛋白水平表達(dá)呈負(fù)相關(guān),mi R-335能夠與c-Met m RNA 3’UTR區(qū)特異性結(jié)合并抑制其表達(dá),mi R-335在翻譯后修飾水平調(diào)控c-Met的表達(dá)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)驗(yàn)證了mi R-335與c-Met的靶向關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：miR-335 乳腺癌 增殖 遷移 c-Met
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 第一部分：Mi R-335 對(duì)MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響17-34
• 1 材料與方法17-26
• 2 結(jié)果26-32
• 3 討論32-34
• 第二部分：mi R-335 與C-met靶向關(guān)系的驗(yàn)證34-49
• 1 材料與方法34-43
• 2 結(jié)果43-47
• 3 討論47-49
• 全文總結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 文獻(xiàn)綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 致謝62-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文63

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本文編號(hào)：1066679