發(fā)布時間：2017-10-18 13:51

  本文關(guān)鍵詞：TALEN介導MGC803細胞MYH9基因沉默及其對細胞增殖和凋亡的影響

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【摘要】：胃癌(gastric cancer, GC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一,也是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因。根據(jù)美國癌癥協(xié)會2015年最新統(tǒng)計的全球癌癥數(shù)據(jù)表明,截止2012年,全世界每年約有95.16萬胃癌新增病例,并且每年大約有72.31萬人死于胃癌。中國、日本和韓國等東亞地區(qū)國家依舊是全世界胃癌高發(fā)地區(qū),日本和韓國等發(fā)達國家因經(jīng)濟水平高、醫(yī)療服務(wù)體系健全,早期發(fā)現(xiàn)診斷胃癌患者居多,所以預后相對較好；約40%的胃癌發(fā)生于中國,而中國因經(jīng)濟條件差、醫(yī)療水平相對落后,許多胃癌患者明確診斷時已經(jīng)處于中晚期,因此胃癌死亡率明顯高于前者。在我國,最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,2015年中國估計有429.2萬個癌癥新發(fā)病例和281.4萬例癌癥死亡病例。胃癌發(fā)病率位居男性和女性腫瘤發(fā)病原因的第二位和第三位,同時也位居因惡性腫瘤死亡原因的前列。盡管隨著大量臨床、基礎(chǔ)研究的進行以及科技的進步與發(fā)展,胃癌的診療技術(shù)取得了長足發(fā)展,但其預后仍不容樂觀。影響胃癌預后的因素很多,其中浸潤轉(zhuǎn)移仍然是影響胃癌預后的主要因素之一,腹膜轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移方式,占所有轉(zhuǎn)移病例的31%,平均生存時間不足6個月。腹膜轉(zhuǎn)移后導致腫瘤無法根治性切除,同時腹膜轉(zhuǎn)移常合并粘連性腸梗阻、大量腹水等癥狀,這些因素常導致患者生存質(zhì)量差、短期死亡。因此,我們應(yīng)該積極尋找胃癌發(fā)生發(fā)展過程中與腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子,研究胃癌發(fā)生發(fā)展及腹膜轉(zhuǎn)移過程中的具體分子機制,為胃癌患者的個體化治療提供依據(jù)。只有通過這種方式,才有可能做到胃癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療,改善胃癌患者的預后,為胃癌診療技術(shù)的發(fā)展打下堅實的基礎(chǔ)。為了更好的研究與胃癌發(fā)生發(fā)展及腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子調(diào)控機制,我們首先必須得了解腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)理論知識。腫瘤是由遺傳因素、環(huán)境因素及生活習慣等造成的,是一個分階段、分步驟,并由多種信號通路共同參與的極為復雜的過程。目前公認的關(guān)于胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移的理論主要有四種,直接侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在胃癌中最為常見,它主要表現(xiàn)為腫瘤細胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移到胃周各站淋巴結(jié),此外,腫瘤還可以跳躍轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移至遠處淋巴結(jié),胃周淋巴結(jié)的清掃對于胃癌術(shù)后病理分期、后續(xù)治療及預后的評估具有重要作用。種植轉(zhuǎn)移是引起胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的主要原因,胃癌起源于粘膜層,突破漿膜層后因腫瘤細胞脫落至腹腔引起胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。既往大量研究證明,正常組織、腫瘤原發(fā)灶和腫瘤轉(zhuǎn)移灶之間存在許多的差異性表達基因,正是因為這些差異性表達的基因,導致的腫瘤細胞的生長代謝、粘附能力、運動能力等出現(xiàn)明顯改變,進而引起腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯增強。近年來,隨著蛋白質(zhì)組學(proteomics)技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)組學逐漸成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一。在對癌癥等人類重大疾病的臨床診斷和治療方面,蛋白質(zhì)組技術(shù)也有十分誘人的前景。蛋白質(zhì)是生理功能和生命現(xiàn)象的執(zhí)行者與直接體現(xiàn)者,因此,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究將有助于闡明生命在不同條件下的變化機制。蛋白質(zhì)自身的存在形式與活動規(guī)律,例如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)之間相互作用及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問題,仍依靠直接對蛋白質(zhì)功能的研究來解決,因為蛋白質(zhì)復雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細胞定位或遷移、蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用等幾乎無法從mRNA水平來判斷。蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳—質(zhì)譜(Two-dimensional polyacry-lamide gel electrophoresis- mass spec-trometry,2-DE-MS)技術(shù),即利用雙向凝膠電泳將所有蛋白質(zhì)分離,然后通過質(zhì)譜對蛋白質(zhì)逐一鑒定,因雙向凝膠電泳技術(shù)具有繁瑣、不穩(wěn)定和低靈敏度等缺點,熒光差異凝膠電泳(difference gel electrophoresis, DIGE)技術(shù)因具有高通量、高靈敏度及高精度等優(yōu)勢,逐漸成為最受歡迎的蛋白組學研究技術(shù)之一。立足于臨床,針對胃癌復發(fā)轉(zhuǎn)移給臨床工作帶來的挑戰(zhàn),旨在尋找與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標志物和生物治療靶點。前期運用蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)對6例胃癌晚期患者(行腹腔鏡下胃癌姑息性切除術(shù))的腫瘤原發(fā)灶、腹膜轉(zhuǎn)移灶及相應(yīng)胃正常上皮間組織標本進行差異蛋白質(zhì)組分析,共鑒定出35個胃癌組織中表達異常的蛋白質(zhì),經(jīng)進一步分析及驗證,發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈(Myosin, heavy chain 9,non-muscle,MYH9)及人類紅細胞膜整合蛋白樣蛋白2(Stomatin-like protein 2, SLP-2)與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者預后相關(guān)。根據(jù)文獻報道,MYH9參與細胞的極性形成、收縮、遷移、細胞分裂等過程,它與許多疾病的發(fā)生有關(guān),如遺傳性血小板減少癥、皰疹病毒感染及胚胎發(fā)育等。其在諸多實體腫瘤中表達異常,在胃癌、結(jié)腸癌、食管癌及乳腺癌中促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,而在頭頸部鱗癌中扮演抑癌角色,并與預后呈正相關(guān)。作為細胞中的“分子馬達”,MYH9異常如何影響胃癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移引起我們的興趣,我們前期通過慢病毒干擾構(gòu)建MYH9基因敲低穩(wěn)定細胞株,采用最有效和最穩(wěn)定單克隆株進行相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)：干擾組感染病毒的胃癌細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞間連接疏松、細胞胰酶消化時收縮能力減弱；熒光顯微鏡下同一視野感染病毒的細胞與未感染細胞形態(tài)相差顯著。同時,MYH9基因敲低后細胞水平遷移能力增強、侵襲能力減弱。經(jīng)查閱相關(guān)文獻,遷移與侵襲能力不一致考慮MYH9作為一個骨架蛋白,主要參與細胞錨定、粘附等過程。因此MYH9減少使細胞粘附減少,水平隨機運動增強。因慢病毒干擾構(gòu)建MYH9基因敲低穩(wěn)定細胞株存在一些局限性：1、MYH9基因敲低細胞株構(gòu)建成功后,隨著細胞培養(yǎng)及傳代次數(shù)增加,未轉(zhuǎn)染進病毒的細胞增殖逐漸增多,不能獲得穩(wěn)定敲低的細胞株；2、慢病毒轉(zhuǎn)進去后,能在顯微鏡下觀察到熒光,但其不發(fā)揮相應(yīng)的作用。為進一步驗證慢病毒干擾構(gòu)建MYH9基因敲低穩(wěn)定細胞株后的相關(guān)生物學功能,同時作為潛在的治療靶點及預后指標,MYH9如何影響胃癌細胞生物學行為也是我們后續(xù)的分子機制研究重點。因此,獲得可靠的基因敲除細胞模型是深入研究特定基因功能的有力保證。隨著分子生物學相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展,基因編輯技術(shù)不斷涌現(xiàn)并改進,本研究選用效果穩(wěn)定可靠的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN)技術(shù)構(gòu)建胃癌細胞系MGC803 MYH9基因沉默單克隆株模型,并初步檢測MYH9沉默后對細胞增殖和凋亡的影響,為進一步探索MYH9分子機制提供可靠模型及潛在研究方向,為研究胃癌與腹膜轉(zhuǎn)移的分子機制奠定基礎(chǔ)。本課題由兩個部分組成,具體內(nèi)容如下：第一章利用TALEN技術(shù)構(gòu)建胃癌細胞MYH9基因沉默細胞株目的：利用新興的基因編輯技術(shù)TALEN技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的胃癌細胞MGC803MYH9基因沉默細胞株。方法：根據(jù)斯丹賽FastTALETM TALEN試劑盒說明書,設(shè)計并構(gòu)建靶向MYH9基因的TALEN質(zhì)粒對。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、DNA測序、RT-PCR和western blot等檢測質(zhì)粒活性,成功挑取MYH9基因敲低單克隆株。結(jié)果：成功構(gòu)建MYH9基因敲低單克隆細胞株,因MYH9敲除后細胞致死性,無法得到MYH9基因完全敲除細胞株。第二章MGC803 MYH9基因敲低細胞株驗證及其對細胞增殖和凋亡的影響。目的：驗證TALEN技術(shù)構(gòu)建的MYH9基因沉默穩(wěn)定細胞株,并對其相關(guān)的細胞增殖和凋亡進行研究,為探索MYH9分子機制提供可靠模型及潛在研究方向。方法：利用qRT-PCR和Western blot方法在mRNA和蛋白水平進行驗證,并對構(gòu)建成功的細胞株進行細胞增殖和凋亡實驗。結(jié)果：1.成功挑選的單克隆細胞株中MYH9基因在mRNA和蛋白水平均明顯低于野生型對照組。2.MYH9敲低后細胞增殖能力下降。3.與野生型對照組相比,MYH9基因敲低后細胞增殖能力下降,細胞周期受阻于G2/M期(P=0.024),不能進入M期進行正常的有絲分裂,同時早期凋亡細胞數(shù)目明顯增加(P=0.01),差異有統(tǒng)計學意義。通過上述研究,我們可以得到以下結(jié)論：1.通過TALEN技術(shù),我們成功構(gòu)建了胃癌細胞MGC803 MYH9基因穩(wěn)定敲低細胞株,通過對其驗證及相關(guān)細胞功能學實驗,我們得到了穩(wěn)定的胃癌MYH9基因敲低單克隆細胞株,為進一步研究胃癌MYH9功能提供了可靠模型,同時也說明TALEN技術(shù)是一種有效、穩(wěn)定的基因編輯技術(shù)。2.因只能獲得MYH9基因敲低細胞株,而無法得到MYH9基因完全敲除細胞株,這也從側(cè)面反應(yīng)出了MYH9基因的重要性。3.MYH9基因敲低后細胞增殖能力下降,細胞周期受阻于G2/M期、早期凋亡增加,對于細胞凋亡增多,無法用MYH9基因作為一個骨架蛋白來解釋,MYH9是否通過其它機制影響胃癌的發(fā)生發(fā)展?這為進一步研究MYH9基因分子機制提供了潛在研究方向。本研究的創(chuàng)新之處：首次利用基因編輯技術(shù)TALEN技術(shù)成功構(gòu)建胃癌細胞MGC803 MYH9基因敲低細胞株。
【關(guān)鍵詞】：TALEN MYH9 細胞增殖 細胞周期 細胞凋亡
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-21
• 第一章 利用TALEN技術(shù)構(gòu)建胃癌細胞MYH9基因沉默細胞株21-36
• 1 實驗材料21-23
• 1.1 細胞系及培養(yǎng)條件21
• 1.2 主要試劑及耗材21-22
• 1.3 主要儀器22-23
• 1.4 主要溶液配制23
• 2 試驗方法23-31
• 2.1 細胞培養(yǎng)、凍存及復蘇23-25
• 2.2 TALEN質(zhì)粒左右臂構(gòu)建25-29
• 2.3 TALEN質(zhì)粒活性檢測29-30
• 2.4 利用TALEN質(zhì)粒建立MGC-803MYH9基因敲低細胞系30-31
• 3 結(jié)果31-33
• 3.1 構(gòu)建TALEN質(zhì)粒左右臂31
• 3.2 轉(zhuǎn)染細胞并測活性31-32
• 3.3 篩選陽性克隆并成功構(gòu)建MYH9基因敲低單克隆細胞株32-33
• 4 討論33-36
• 第二章 MGC803 MYH9基因沉默細胞株驗證及細胞增殖與凋亡功能檢測36-55
• 1 實驗材料36-38
• 1.1 主要試劑及耗材36
• 1.2 主要儀器36-37
• 1.3 主要溶液配制37-38
• 2 實驗方法38-48
• 2.1 qRT-PCR檢測胃癌細胞中MYH9 mRNA表達38-41
• 2.2 Western blot檢測胃癌細胞中MYH9蛋白表達41-47
• 2.3 CCK-8法檢測細胞增殖47
• 2.4 流式細胞儀檢測細胞周期47-48
• 2.5 細胞凋亡實驗檢測細胞凋亡情況48
• 2.6 統(tǒng)計方法48
• 3 結(jié)果48-53
• 3.1 胃癌細胞株中MYH9基因在mRNA水平的表達情況48-49
• 3.2 胃癌細胞株中MYH9基因在蛋白水平的表達情況49-50
• 3.3 MYH9基因敲低后細胞生長速度受到抑制50-51
• 3.4 MYH9基因敲低后細胞周期受阻于G2/M期51-52
• 3.5 MYH9基因敲低后細胞早期凋亡增加52-53
• 4 討論53-55
• 全文小結(jié)55-56
• 參考文獻56-63
• 中英文縮略詞表63-66
• 攻讀碩士學位期間成果66-67
• 致謝67-69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Incidence and mortality of gastric cancer in China[J];World Journal of Gastroenterology;2006年01期

，

本文編號：1055294