本文關(guān)鍵詞：FHL2參與調(diào)節(jié)KLF8促進結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究

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【摘要】：目的和意義FHL2(Four and a halfLIM Protein 2)為確定的癌基因,在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。最近已有研究報道了FHL2下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,但其上游的相關(guān)調(diào)控報道甚微。結(jié)合文獻,我們通過軟件篩選出轉(zhuǎn)錄因子KLF8 (Kruppel-like factor 8)為FHL2可能的調(diào)控因子。Kruppel-like factor 8(KLF8)是作為K ruppel樣Cys2/His2鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)家族的一個轉(zhuǎn)錄抑制蛋白而被識別的,通過與輔抑制子碳端結(jié)合蛋白(CtBP)相聯(lián)系抑制基因表達。最近有研究表明KLF8在卵巢癌、腎癌以及乳腺癌中表達是升高的,但是在腸癌組織細胞中的表達及其與腸癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移尚無相關(guān)報道。同時本課題旨在明確KLF8與FHL2上游啟動子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系,從而尋找能靶向調(diào)控FHL2表達的元件,以期應(yīng)用于腫瘤的生物靶向治療。材料和方法主要材料Lovo、SW480、SW1116、Caco2、SW620.HT29和DLD1細胞,rTGF-β1、TGF-β1中和抗體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、CHIP試劑盒、突變試劑盒、KLF8抗兔多克隆抗體、FHL2抗鼠多克隆抗體、羅丹明標記鬼筆環(huán)肽。主要方法1.KLF8對腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的影響1.1 KLF8過表達穩(wěn)定株的構(gòu)建及KLF8對腸癌EMT的影響轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF8和對照pcDNA3.1質(zhì)粒到Lovo細胞,48小時后用含有600μg/mlG418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周,挑選單克隆細胞,并用800μg/ml G418培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),建立單克隆穩(wěn)定表達株,western blot驗證穩(wěn)定克隆細胞中KLF8的表達情況。western blot檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF8和對照pcDNA3.1質(zhì)粒細胞中的E-cadheri、Vimentin及N-cadhenrin的表達情況。1.2 KLF8對腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響接種適當密度轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF8和對照pcDNA3.1質(zhì)粒細胞至6孔板中,待融合度近100%時,用移液器槍頭進行劃痕,鏡下記錄劃痕區(qū)相對距離,繼續(xù)培養(yǎng),分別于12和24小時再次拍照記錄,評估腸癌細胞的轉(zhuǎn)移能力；種轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF8和對照pcDNA3.1質(zhì)粒的單細胞懸液(5×105/室)至Matrigel侵襲小室,室內(nèi)為無血清培養(yǎng)基,室外為10%胎牛血清培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)24小時,0.2%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量,評價高表達KLF8對細胞侵襲能力的影響。1.3 rTGF-β1對KLF8及EMT的影響western blot檢測不同濃度(0、0.5、1.0、2.0ng/ml) rTGF-β1處理Lovo細胞后蛋白中KLF8、E-cadherin 和vimentin的表達。用含有2μg/ml TGF-β1的中和抗體及對照正常鼠IgG抗體(normal mouse IgG, mIgG)的培養(yǎng)基孵育SW480細胞過夜,第二天分別加或不加rTGF-β1 (2ng/ml)刺激,繼續(xù)孵育48小時,western b lot方法檢測KLF8、E-cadherin和vimentin的表達。轉(zhuǎn)染KLF8-siRNA和對照Scr-siRNA入Lovo細胞,24小時后加或不加rTGF-β1,繼續(xù)孵育48小時,western blot檢測KLF8、E-cadherin和vimentin的表達。2.KLF8和FHL2在原發(fā)性腸癌、轉(zhuǎn)移癌組織及細胞內(nèi)的表達情況2.1 KLF8和FHL2在原發(fā)性腸癌及轉(zhuǎn)移癌組織中的表達收集15對以上來自同一腸癌病人的原發(fā)與轉(zhuǎn)移癌(淋巴結(jié)或肝轉(zhuǎn)移)手術(shù)標本,在連續(xù)切片中分別應(yīng)用KLF8和FHL2抗體進行免疫組織化學染色。2.2 KLF8和FHL2在腸癌細胞內(nèi)的表達提取Lovo, SW1116, SW620, HT-29, DLD1, CaCo2, SW480的細胞蛋白,用western blotti ng技術(shù)檢測不同腸癌細胞中KLF8和FHL2的表達水平,并間接免疫熒光染色方法檢測KLF8與FHL2兩蛋白的細胞內(nèi)亞分布。3.KLF8與FGL2的關(guān)系3.1 FHL2啟動子區(qū)域內(nèi)KLF8的結(jié)合位點通過使用生物信息學軟件預(yù)測FHL2啟動子區(qū)域內(nèi)的KLF8結(jié)合位點,為了獲得更多KLF8與FHL2啟動子結(jié)合的證據(jù),我們利用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法,探索FHL2啟動子區(qū)域內(nèi)KLF8的結(jié)合位點。3.2雙熒光素酶檢測FHL2啟動子區(qū)域內(nèi)KLF8結(jié)合位點的活性根據(jù)FHL2啟動子(500bp)內(nèi)KLFs的位置設(shè)計三對引物,擴增FHL2基因5’端上游啟動子序列,分別插入到pGL3-Basic載體,構(gòu)建質(zhì)粒pluc55、pluc201和pluc498,瞬時轉(zhuǎn)染入不同KLF8表達狀態(tài)的腸癌細胞,進行雙熒光素檢測。3.3定點突變重組質(zhì)粒并檢測其活性變化按照突變試劑盒設(shè)計突變引物,以pluc-55為模板進行擴增得到KLF8結(jié)合位點突變的產(chǎn)物,產(chǎn)物用DpnI酶切可將未突變的模板質(zhì)粒清除,然后轉(zhuǎn)化入Epicurian coli XL 1-blue感受態(tài)細胞擴增,再將突變質(zhì)粒測序鑒定后命名為plucMT。將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)48小時后收集細胞進行雙熒光素酶報告基因檢測。4.下調(diào)FHL2對KLF8誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌EMT的影響及其對KLF8誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響4.1 FHL2低表達對KLF8誘導(dǎo)的EMT的影響在KLF8過表達穩(wěn)定株(Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDNA3.1-KLF8)中,瞬時轉(zhuǎn)染Scr-RNA或FHL2-siRNA,48小時后,vestern blot檢測FHL2、E-cadherin、 Vimentin、N-cadherin表達；另外用免疫熒光染色實驗觀察E-cadherin和 Vimentin在Lovo-KLF8-src-siRNA和SW480-KLF8-FHL2-siRNA兩個細胞中分布的變化。4.2 FHL2低表達對KLF8誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響(1)WST-1實驗驗證FHL2對KLF8調(diào)節(jié)的結(jié)直腸癌細胞增殖的影響在過表達KLF8穩(wěn)定株(Lovo-pcDNA3.1-KLF8)中,瞬時轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA或Scr-RNA,分別種植0、24、48、72小時后的單細胞懸液于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,向每孔中加入10μl WST-1溶液,4小時后測定450nm處的吸光度。(2)壓低FHL2表達對KLF8誘導(dǎo)的腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響取適當密度KLF8過表達穩(wěn)定株(Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDN A3.1-KLF8)瞬時轉(zhuǎn)染Scr-RNA或FHL 2-siRNA后的單細胞懸液鋪板于六孔板中,待細胞長滿后,用移液器槍頭劃痕,分別于劃痕后0h、12h、24h顯微鏡下拍照,記錄劃痕情況；種KLF8過表達穩(wěn)定株(Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDNA3.1-KLF8)瞬時轉(zhuǎn)染Scr-RNA或FHL2-siRNA后的單細胞懸液(5×105/室)至Matrigel侵襲小室,室內(nèi)為無血清培養(yǎng)基,室外為10%胎牛血清培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)24小時,0.2%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量,評價壓低FHL2對KLF8誘導(dǎo)的侵襲能力的影響。(3)FHL2siRNA對過表達KLF8引起的腸癌細胞形態(tài)的影響顯微鏡白光下觀察過表達KLF8穩(wěn)定株瞬時轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA或Scr-RNA48小時后細胞形態(tài)；蓋玻片上培養(yǎng)過表達KLF8穩(wěn)定株瞬時轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA或Scr-RNA后的細胞,48小時后取出,并進行羅丹明鬼筆環(huán)肽染色,經(jīng)過PBS洗滌后,于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。5.壓低FHL2表達對KLF8誘導(dǎo)的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響5.1皮下腫瘤模型的建立給5-6周齡大小的BALB/c雌性裸鼠皮下分別注射轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、 pcDNA3.1-KLF8-FHL2 siRNA的細胞,35天后處死,對比三組皮下腫瘤大��；腫瘤連續(xù)切片免疫組化驗證Ki-67和CD105的表達情況。5.2脾被膜下肝轉(zhuǎn)移模型的建立給5-6周齡大小的BALB/c雌性裸鼠脾被膜下分別注射轉(zhuǎn)染pcDNA3.1. pcDNA3.1-KLF8.pcDNA3.1-KLF8-FHL2siRNA的細胞,3周后處死,觀察體內(nèi)肝臟轉(zhuǎn)移瘤大��；并用qRT-PCR驗證三組肝腫瘤內(nèi)E-cadherin的表達。6.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理IHC每張切片隨機選取3-5個不同視野,計算目的蛋白陽性細胞表達率,并進行兩個樣本的配對t檢驗；雙熒光素酶報告基因檢測、PCR、細胞粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移和westrnm blotting灰度值分析結(jié)果用三次實驗結(jié)果先進行方差齊性檢驗,方差齊(P0.05)則進行兩個處理組間獨立樣本t檢驗或多個處理組間one way ANOVA統(tǒng)計分析,整體比較有顯著性差異后多重比較采用LSD法；方差不齊(P0.05)則應(yīng)用S atterthwaite近似t檢驗或Welch檢驗分析,整體比較有顯著性差異后多重比較采用Duunett's T3檢驗。應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)+-標準差表示,p0.05具有顯著性差異。結(jié)果1.KLF8促進腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移1.1過表達KLF8對腸癌細胞EMT的作用通過western blot證實KLF8與E-cadherin血呈負相關(guān)關(guān)系,與V imentin、 N.cadherin呈正相關(guān)關(guān)系。1.2 KLF8對腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用劃痕和侵襲實驗表明KLF8表達水平與腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。1.3 rTGF-β1對KLF8及EMT的影響腸癌細胞內(nèi)KLF8的表達對rTGF-β1存在劑量依賴性,濃度越高的rTGF-β1導(dǎo)致KLF8的表達增高,并且降低E-cadherin而增加Vimentin的表達水平；內(nèi)外源性rTGF-β1引起的KLF8表達均可以受到TGF-β1中和抗體的抑制；KLF8siRNA阻斷了rTGF-β1引起的Vmehtin的表達,而增加E-cadherin表達。2.KLF8與FHL2在腸癌組織和細胞中的表達關(guān)系2.1 KLF8與FHL2在原發(fā)性腸癌及轉(zhuǎn)移癌組織中的表達免疫組化實驗證實KLF8與FHL2在腸癌組織中表達水平均顯著高于鄰近正常腸組織,且同位點胞漿和胞核內(nèi)均有表達,通過Spearman分析得出二者表達呈正相關(guān)；二者在轉(zhuǎn)移癌中的表達均呈陽性表達。2.2 KLF8與FHL2在腸癌細胞內(nèi)同向表達并具有相關(guān)性Western blot證實,KLF8在腸癌細胞SW480、SW1116、Caco2和SW620均呈高表達,而在HT29、DLD1和Lovo細胞內(nèi)呈較低表達。FHL2在上述腸癌細胞內(nèi)的表達趨勢與KLF8一致,除SW480外。并且間接免疫熒光實驗顯示KLF8與FHL2的表達位于Lovo的胞核和胞漿內(nèi)。3.FHL2是KLF8轉(zhuǎn)錄活性的直接目標3.1 FHL2啟動子區(qū)域存在KLF8結(jié)合位點生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：在FHL2啟動子500bp內(nèi)存在3個GT盒子：分別位于-50-55bp(GT盒子1),-192--201bp(GT盒子2)和-493--498bp(GT盒子3)。CHIP結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加了KLF8抗體組內(nèi)GT盒子1處有條帶出現(xiàn),加了對照抗體IgG和未加KLF8抗體處均未見條帶出現(xiàn)。3.2雙熒光素酶基因報告實驗證明KLF8與GT盒子1結(jié)合將FHL2啟動子區(qū)域內(nèi)的三個GT盒子接入pGL3-Basic載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Lovo-pcDNA3.1、Lovo-pcDNA3.1-KLF8中進行雙熒光素酶檢測,結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染含有GT盒子1質(zhì)粒的高表達KLF8細胞組活性明顯高于對照組,轉(zhuǎn)染含GT盒子2和GT盒子3質(zhì)粒的高表達KLF8細胞組與對照組細胞無明細差異。3.3定點突變重組質(zhì)粒對FHL2啟動子活性的影響按照定點突變試劑盒突變設(shè)計突變引物,以重組質(zhì)粒pLuc-55為模板,構(gòu)建突變質(zhì)粒pluc-MT,將野生型和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入不同KLF8表達狀態(tài)的腸癌細胞進行雙熒光素酶檢測,顯示：轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的高表達KLF8細胞組活性明顯高于對照組,而轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的高表達KLF8細胞組與對照組無明細差異。4. FHL2siRNA抑制KLF8誘導(dǎo)腸癌細胞的EMT和腸癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力,并影響KLF8誘導(dǎo)腸癌細胞形態(tài)的變化4.1 FHL2siRNA抑制KLF8誘導(dǎo)腸癌細胞的EMTWestern blot證實：在KLF8過表達穩(wěn)定株中轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA可促進E-cadherin的表達,并且抑制Vimentin和N-cadherin的表達。免疫熒光實驗結(jié)果同樣證實：在KLF8穩(wěn)定表達株中壓低FHL2可促進E-cadherin的表達,抑制Vimentin的表達。4.2 FHL2siRNA抑制KLF8誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增殖試驗提示轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA的KLF8過表達穩(wěn)定株的OD450s明顯低于轉(zhuǎn)染Scr-RNA的KLF8過表達穩(wěn)定表達株。對比0h、12h、24h的劃痕實驗結(jié)果,敲低KLF8過表達穩(wěn)定株中FHL2的表達引起腸癌細胞遷移速度的降低；Transwell試驗顯示KLF8過表達穩(wěn)定株轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA后的細胞侵襲率明顯低于KLF8過表達穩(wěn)定株。4.3 FHL2低表達對KLF8引起的腸癌細胞形態(tài)變化的影響KLF8過表達穩(wěn)定株細胞呈現(xiàn)出一種細長如成纖維細胞的形態(tài),而對照細胞及轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA的KLF8穩(wěn)定表達株均呈現(xiàn)出圓的和平坦的細胞形態(tài)。羅丹明結(jié)果顯示：過表達KLF8穩(wěn)定細胞邊緣地帶突出,而且絲狀偽足和板狀偽足是細胞膜表面的動態(tài)特征,與癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),而轉(zhuǎn)染FHL2-siRNA的KLF8穩(wěn)定表達株細胞邊緣未伸出偽足。5.FHL2低表達對體內(nèi)KLF8誘導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移作用的阻斷5.1 FHL2低表達減小KLF8誘導(dǎo)的裸鼠皮下腫瘤大小裸鼠皮下成瘤,對比三組皮下腫瘤大小,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF8細胞組的腫瘤明顯大于轉(zhuǎn)染p cDNA3.1及在KLF8高表達FHL2低表達穩(wěn)定株的細胞組腫瘤；另外腫瘤切片免疫組化結(jié)果證實：在注射KLF8過表達穩(wěn)定株組中,Ki-67和CD105的表達明顯高于另外兩組。5.2 FHL2低表達抑制KLF8誘導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)移脾被膜下注射三組細胞23天后處死,觀察結(jié)果提示：注射KLF8過表達穩(wěn)定株組的肝臟轉(zhuǎn)移瘤比另外兩組較大；qRT-PCR證實：KLF8過表達穩(wěn)定株內(nèi)E.cadherin的mRNA表達水平較對照組及KLF8過表達而FHL2低表達穩(wěn)定株低。結(jié)論1.KLF8促進腸癌的EMT及侵襲轉(zhuǎn)移活性；2.FHL2和KLF8在腸癌及轉(zhuǎn)移瘤組織細胞中的表達呈正相關(guān)；3.CHIP實驗、雙熒光素酶、基因突變實驗相互印證在FHL2啟動子區(qū)域55bp處存在KLF8結(jié)合位點；4.FHL2siRNA抑制KLF8誘導(dǎo)腸癌EMT和腸癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力,并改變其誘導(dǎo)的細胞形態(tài)變化；5.體內(nèi)實驗再次印證FHL2參與調(diào)節(jié)KLF8誘導(dǎo)的EMT和侵襲轉(zhuǎn)移。FHL2為癌基因,KLF8是正向調(diào)節(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子,FHL2和KLF8的相互作用,在大腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。KLF8 promotes tumorigenesis, invasion and metastasis of colorectal cancer cells by transcriptional activation of FHL2
【關(guān)鍵詞】：KLF8 FHL2 結(jié)直腸癌 EMT
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 前言23-26
• 一、實驗材料26-32
• 二、實驗方法32-50
• 三、結(jié)果50-67
• 四、討論67-74
• 五、全文小結(jié)74-75
• 六、參考文獻75-82
• 中英文縮略詞對照表82-84
• 在讀期間撰寫論文情況84-85
• 致謝85-86

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本文編號：1028158