本文關(guān)鍵詞：SEMA3A在胃癌增殖及侵襲中的初步研究

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【摘要】：【背景】在我國,胃癌是死亡率最高的消化道惡性腫瘤之一,而胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是患者不良預(yù)后的主要原因,一經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,胃癌患者的生存期常小于1年。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個相對復(fù)雜的生物學(xué)過程,而其轉(zhuǎn)移常伴隨著某些細(xì)胞因子及信號通路的改變。近幾年,分子靶向治療在多種腫瘤的臨床實踐中已經(jīng)發(fā)揮了顯著療效,在無法切除的局部晚期或晚期的胃癌患者中,針對Her-2高表達(dá)的曲妥珠單抗靶向藥物聯(lián)合化療大大提高了胃癌治療的有效率,延長了患者的總生存期,成為了晚期胃癌患者治療的里程碑事件。然而,Her-2基因擴增在胃癌患者中不足20%,可見,發(fā)掘胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移新的靶標(biāo)分子可能會為胃癌的治療提供一種新的方法,同時可以改善患者的生活質(zhì)量,并延長患者的生存時間。Semaphorin3A(Sema3A),作為3型Sema的成員之一,是具有神經(jīng)生長抑制作用的外分泌型蛋白,最早是在脊椎動物被鑒定的信號蛋白。近幾年大量的研究證實,在多種惡性腫瘤中(如乳腺癌,前列腺癌,胰腺癌,惡性黑色素瘤等),Sema3A出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)下調(diào)或缺失,參與了腫瘤惡性生物學(xué)行為的發(fā)生發(fā)展。我們課題組初步研究發(fā)現(xiàn),與正常人外周血中的表達(dá)相比,Sema3A在胃癌患者外周血中是低表達(dá)的,提示Sema3A的表達(dá)下調(diào)可能在胃癌中也發(fā)揮了作用。為了進(jìn)一步探討Sema3A在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)的機制,本課題組設(shè)計了以下實驗進(jìn)行研究�！灸康摹�1.研究Sema3A在胃癌患者以及胃癌組織中的表達(dá)情況,檢測Sema3A在胃癌細(xì)胞系,尤其是高低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系中的表達(dá)差異,觀察其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用;2.構(gòu)建Sema3A過表達(dá)細(xì)胞株,利用體外增殖及侵襲遷移等實驗探討Sema3A在胃癌惡性生物學(xué)行為中的作用;3、初步探究Sema3A在胃癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機制。【方法】1.通過ELISA、RT-PCR、Western Blot等實驗方法檢測胃癌患者外周血、胃癌組織、胃癌細(xì)胞系中Sema3A的表達(dá);2.構(gòu)建Sema3A過表達(dá)的慢病毒載體,并感染高轉(zhuǎn)移能力的胃癌MKN28-M細(xì)胞,獲得外源性穩(wěn)定表達(dá)Sema3A的胃癌細(xì)胞株;3.在穩(wěn)定表達(dá)Sema3A的胃癌細(xì)胞系中,通過MTT實驗、平板集落克隆實驗、流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡實驗等檢測其對胃癌細(xì)胞MKN28-M凋亡的影響。4.通過Transwell侵襲實驗以及細(xì)胞劃痕實驗研究Sema3A對胃癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響;5.通過Western Blot實驗檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路蛋白在Sema3A高表達(dá)及對照細(xì)胞系中的表達(dá)差異;6.利用Western Blot、RT-PCR實驗檢測上調(diào)Sema3A的表達(dá)對EMT發(fā)生的影響�！窘Y(jié)果】1.與正常人相比,胃癌患者血清中Sema3A的表達(dá)明顯降低;與癌旁組織相比,胃癌組織中Sema3A的表達(dá)明顯降低或缺失,進(jìn)一步分析病人的臨床資料發(fā)現(xiàn),Sema3A表達(dá)缺失的患者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一現(xiàn)象。同樣,Sema3A在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的表達(dá)也顯著低于親本胃癌細(xì)胞系。2.慢病毒包裝Sema3A正義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞MKN28-M后,RT-PCR和Western blot實驗證實上調(diào)了Sema3A基因的表達(dá)。3.體外實驗證實外源性上調(diào)Sema3A的表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡。4.體外實驗證實外源性上調(diào)Sema3A的表達(dá)降低了胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。5.外源性上調(diào)Sema3A后,抗凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl表達(dá)下降,而促凋亡蛋白Bax,Fas-L表達(dá)增加。6.外源性上調(diào)Sema3A后,促進(jìn)EMT發(fā)生的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug、Zeb-1的表達(dá)減少,EMT相關(guān)的上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)增加,然而間質(zhì)標(biāo)記分子Vimentin、N-cadherin等表達(dá)則明顯下降。上述結(jié)果提示Sema3A在胃癌細(xì)胞中表達(dá)的降低導(dǎo)致了胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,促進(jìn)了胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,而上調(diào)Sema3A后逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象�！窘Y(jié)論】與正常對照組相對比,Sema3A在胃癌患者,組織胃癌患者外周血及轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞株中均是表達(dá)下降的,且在胃癌高轉(zhuǎn)移潛能MKN28-M細(xì)胞中表達(dá)最低,提示Sema3A表達(dá)下調(diào)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。我們成功構(gòu)建外源性過表達(dá)Sema3A基因的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染入MKN28-M細(xì)胞系后,上調(diào)Sema3A基因的表達(dá)后,通過體外表型實驗證實Sema3A的過表達(dá)顯著降低了胃癌高轉(zhuǎn)移MKN28-M細(xì)胞系的增殖能力,抑制了侵襲、遷移能力。進(jìn)一步探究Sema3A在胃癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)作用機制,發(fā)現(xiàn)上調(diào)Sema3A后是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族和死亡受體通路相關(guān)分子的表達(dá)變化來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡,抑制胃癌細(xì)胞的增殖;同時通過逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生降低了胃癌細(xì)胞的侵襲能力。這些研究結(jié)果揭示,Sema3A對胃癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用,可能為胃癌的靶向治療提供了一定的實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Sema3A 胃癌 增殖 侵襲
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-26
• 第一部分 Sema3A在胃癌患者血清，胃癌組織和細(xì)胞系的表達(dá)26-42
• 1 材料和試劑26-28
• 2 方法28-38
• 3 結(jié)果38-40
• 4 討論40-42
• 第二部分 Sema3A在胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用42-53
• 1 材料和儀器42-43
• 2 方法43-47
• 3 結(jié)果47-51
• 4 討論51-53
• 第三部分 Sema3A參與胃癌凋亡及轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制研究53-59
• 1 材料53-54
• 2 方法54-55
• 3 結(jié)果55-57
• 4 討論57-59
• 小結(jié)59-61
• 附錄61-62
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 個人簡歷和研究成果70-71
• 致謝71

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本文編號：1017891