本文關(guān)鍵詞：蚓激酶活性及蛋白成分的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蚓激酶(Lumbrokinase,LK)又稱蚯蚓纖溶酶,是一類來源于蚯蚓的具有纖溶活性蛋白酶的總稱。自1983年日本學(xué)者Mihara等從粉正蚓中分離到6種具有纖溶活性的蛋白質(zhì)以來,許多學(xué)者對蚓激酶進行了系統(tǒng)的研究。文獻報道蚓激酶的主要成分是一組來源于蚯蚓的絲氨酸蛋白酶,包括纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原激活物以及類似組織型纖維蛋白溶酶原激活物等。但蚓激酶在國外均沒有作為藥品上市。我國于1992年上市,臨床應(yīng)用于缺血性腦血管病中纖維蛋白原增高及血小板凝集率增高的患者。全國有5家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)蚓激酶原料及腸溶制劑,其生產(chǎn)原料均來源于人工養(yǎng)殖的赤子愛勝蚓(Eisenia fetida),生產(chǎn)工藝簡單粗放。蚓激酶作為我國特有的一種酶類生化藥物,在臨床上應(yīng)用廣泛,療效好。但是,由于其前期研究基礎(chǔ)不足,產(chǎn)品的有效成分、活性研究、控制方法等均比較薄弱,有必要采用現(xiàn)代分析技術(shù)對產(chǎn)品中存在的問題深入研究,從而對產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性提升提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。為此,本文采用質(zhì)譜、酶譜、親和層析、離子交換層析、纖維平板量反應(yīng)平行線法等手段,對蚓激酶的成分組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、質(zhì)量控制方法等進行了系統(tǒng)研究。本文重點從三個方面對蚓激酶進行研究。蚓激酶組成成分研究采用胰凝乳蛋白酶酶解、LC-MS分離測定、Protein Lynx Global Server 3.0軟件分析,結(jié)果顯示我國該品種的五家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品中主要存在15種蛋白質(zhì),包括4種溶纖酶與10種激酶。其中纖溶酶在每個生產(chǎn)企業(yè)的樣品中均有檢出,一致性較好。蚓激酶國家標準物質(zhì)中檢出5種與溶纖活性相關(guān)的蛋白質(zhì),包括2種纖溶酶與3種激酶。該研究表明國產(chǎn)蚓激酶原料藥中存在蚓激酶活性蛋白成分,存在與溶纖活性相關(guān)的蛋白質(zhì)組分。蚓激酶活性研究重點研究了總活性定量和活性成分識別。對蚓激酶直接纖溶活性及間接纖溶活性進行研究,結(jié)果顯示蚓激酶不僅具有直接降解纖維蛋白的功能,還有激活纖維蛋白溶酶原起到間接溶解纖維蛋白的功能�；隍炯っ傅纳飳W(xué)活性及傳統(tǒng)效價測定方法的局限,引入了生物統(tǒng)計方法——量反應(yīng)平行線法測定蚓激酶效價。結(jié)果顯示蚓激酶原料藥及標準品均符合量反應(yīng)平行線法統(tǒng)計學(xué)要求,該法更適用于蚓激酶的生物學(xué)活性測定。基于蚓激酶直接降解纖維蛋白的特點,建立測定蚓激酶活性蛋白成分的纖溶酶譜法。結(jié)果顯示纖溶酶譜法能夠清晰的顯示蚓激酶活性蛋白的存在,并且能夠作為評價蚓激酶生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的一種有效的手段。蚓激酶活性蛋白分離純化基于前期初步質(zhì)譜鑒定結(jié)果及酶學(xué)活性,嘗試找到蚓激酶單一活性蛋白。將蚓激酶通過DEAE陰離子交換層析及親和色譜層析純化,得到一組有三個蚓激酶活性蛋白的混合物,經(jīng)質(zhì)譜鑒定,三個活性蛋白成分為纖溶蛋白酶1、蚓激酶F238及蚓激酶3/5,與初步結(jié)果一致。
【關(guān)鍵詞】：蚓激酶 酶譜法 液質(zhì)聯(lián)用 陰離子交換 親和層析
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 英文縮略語11-12
• 前言12-14
• 第一部分 蚓激酶組成成分研究14-25
• 1 儀器與材料14-15
• 1.1 實驗儀器14
• 1.2 實驗材料14-15
• 1.3 主要試劑的配制15
• 2 實驗方法15-18
• 2.1 胰凝乳蛋白酶酶解蚓激酶原料藥15-16
• 2.2 UPLC-ESI-Q-TOF測定蚓激酶總離子流圖16-17
• 2.3 數(shù)據(jù)處理及分析17-18
• 3 實驗結(jié)果18-24
• 3.1 蚓激酶原料藥與標準品LC-MS總離子流圖18-19
• 3.2 蚓激酶原料藥與標準品質(zhì)譜鑒定結(jié)果19-24
• 4 討論與小結(jié)24-25
• 第二部分 蚓激酶酶學(xué)活性研究25-58
• 1 儀器與材料25-29
• 1.1 實驗儀器25-26
• 1.2 實驗材料26
• 1.3 主要試劑的配制26-29
• 2 實驗方法29-34
• 2.1 蚓激酶纖維蛋白溶酶活性的研究29-30
• 2.2 纖維蛋白溶酶原激酶活性研究30-31
• 2.3 量反應(yīng)雙平行線法測定蚓激酶效價31-32
• 2.4 纖溶酶譜32
• 2.5 凝血時間法32-34
• 3 實驗結(jié)果34-56
• 3.1 蚓激酶纖溶活性研究結(jié)果34-35
• 3.2 蚓激酶激酶活性研究結(jié)果35-39
• 3.3 量反應(yīng)平行線法計算蚓激酶效價39-46
• 3.4 纖溶酶譜法的建立46-50
• 3.5 纖溶酶普法在蚯蚓種屬鑒別及生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性評價中的作用50-53
• 3.6 凝血時間法測定效價研究53-56
• 4 討論與小結(jié)56-58
• 第三部分 蚓激酶分離純化研究58-76
• 1 儀器與材料58-62
• 1.1 實驗儀器58
• 1.2 試劑材料58-59
• 1.3 主要試劑的配制59-62
• 2 實驗方法62-68
• 2.1 硫酸銨沉淀、丙酮沉淀、疏水層析62-63
• 2.2 DEAE陰離子交換層析63-64
• 2.3 親和層析64-65
• 2.4 SDS-PAGE及Fibrin-SDS-PAGE65-66
• 2.5 質(zhì)譜鑒定目的蛋白66-68
• 3 實驗結(jié)果68-75
• 3.1 硫酸銨沉淀、丙酮沉淀、疏水層析68-71
• 3.2 DEAE純化蚓激酶活性蛋白71-73
• 3.3 Benzamidine親和層析73
• 3.4 質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)處理73-75
• 4 討論與小結(jié)75-76
• 結(jié)語76-77
• 文獻綜述77-85
• 參考文獻85-89
• 附錄189-90
• 附錄290-91
• 致謝91

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