本文關鍵詞：人與鼠源內皮抑素基因合成和原核表達及功能驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：血管內皮抑素最初是從小鼠血管內皮瘤細胞株的培養(yǎng)基中分離純化而來,一種內源性血管生成抑制劑,是膠原蛋白18C末端的一個片段,能特異性地抑制新生血管內皮細胞的增殖從而抑制血管的增生,內皮抑素不影響已生成成熟血管的功能,因此是一種理想的新生血管生成抑制劑,在臨床上用于抑制腫瘤血管生成從而達到腫瘤治療目的,重組內皮抑素主要通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得,其中絕大部分是以包涵體形式存在。人與鼠源內皮抑素基因具有高度的同源性和相似的生物學功能。本文將確定人與鼠源內皮抑素基因并構建不同表達標簽的原核表達載體探討內皮抑素的可溶性表達以及驗證重組人源內皮抑素對新生血管的抑制作用。方法：根據文獻報道和NCBI數據庫確定Human Endostatin ( IE)和Mouse Endostatin (ME) DNA序列,DNA合成法分別獲得人與鼠源內皮抑素基因,加入不同酶切位點設計引物,進行PCR擴增后膠回收,分別與攜帶谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)表達標簽的原核表達質粒pGEX-4T1和攜帶硫氧還蛋白A(TrxA)表達標簽的原核表達質粒pET-32a進行雙酶切處理、T4DNA連接酶連接,構建原核表達質粒pGEX-4T1-HE 和 pET-32a-ME,將兩種質粒分別轉入大腸桿菌BL21(DE3)用IPTG進行誘導表達,確定人與鼠源內皮抑素的誘導表達條件,將誘導后的菌液超聲破碎,離心后上清和沉淀分別進行蛋白電泳確定蛋白分布,將內皮抑素包涵體洗滌、變性、復性、濃縮后獲得重組蛋白,最后通過雞胚絨毛尿囊膜實驗驗證人源重組內皮抑素蛋白的抗血管生成活性。結果：測序分析表明成功合成人與鼠源內皮抑素基因,通過PCR擴增確定人與鼠源內皮抑素基因大小為560bp左右,與理論符合,通過分子克隆分別將人與鼠源內皮抑素基因連接進入原核表達質粒pGEX-4T1和pET-32a,經PCR、雙酶切、測序分析顯示原核表達載體pGEX-4T1-HE和 pET-32a-ME構建成功,在37℃,1mmol/LIPTG濃度下,大腸桿菌BL21(DE3)中人、鼠源內皮抑素成功表達,通過SDS-PAGE分析,與空白組相比,實驗組出現目的條帶,其中人源內皮抑素重組蛋白在46 kDa處出現,鼠源內皮抑素重組蛋白在39 kDa處出現,與理論相符,人與鼠源內皮抑素主要以包涵體形式表達,在破碎后的菌體上清中沒有發(fā)現內皮抑素的分布,通過對包涵體的洗滌、純化、復性獲得人與鼠源重組內皮抑素蛋白,在雞胚絨毛尿囊膜實驗中,與對照組相比,實驗組的血管數少,血管管徑細。結論：研究結果表明獲得了長度為554 bp的人源內皮抑素基因和長度為565 bp的鼠源內皮抑素基因,成功構建了人與鼠源內皮抑制素基因不同標簽表達載體,在大腸桿菌中成功誘導表達。成功獲得人與鼠源ES重組蛋白；CAM實驗結果也證明了純化復性后的人源重組蛋白能明顯抑制新生血管的生長。我們的研究結果也表明TrxA標簽和GST標簽對增進重組ES可溶表達沒有顯著差異,兩組標簽的重組蛋白都主要存在于包涵體內。
【關鍵詞】：內皮抑素 基因合成 重組蛋白 純化 蛋白標簽 雞胚絨毛尿囊膜試驗
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5;R96
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 英文縮略語表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一節(jié) 人、鼠源內皮抑素原核表達載體構建14-36
• 1.實驗材料14-16
• 2.實驗方法16-28
• 3.結果28-34
• 4 討論34-35
• 5 結論35-36
• 第二節(jié) 人、鼠源內皮抑制素不同標簽重組蛋白的表達純化及活性分析36-47
• 1.實驗材料36-39
• 2.實驗方法39-40
• 3.結果40-44
• 4 討論44-46
• 5 結論46-47
• 課題綜述47-59
• 參考文獻59-69
• 致謝69-70
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄70
• 感謝以下基金對本課題資助70

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前5條

1 肖創(chuàng)清;何云南;;血管內皮抑素的臨床應用進展[J];放射免疫學雜志;2013年05期

2 季現秀;范理宏;;內皮抑素的生物活性及作用機制的研究進展[J];臨床肺科雜志;2010年01期

3 秦叔逵;劉秀峰;王琳;陳映霞;錢軍;華海清;龔新雷;楊柳青;何澤明;;重組人血管內皮抑素與化療聯合治療肺外晚期惡性腫瘤的臨床研究[J];臨床腫瘤學雜志;2007年10期

4 李祥魁;范翠英;崔亞君;劉璇;;重組蛋白可溶性表達促進標簽的研究進展[J];生物技術;2013年02期

5 ;新型重組人血管內皮抑素恩度治療惡性漿膜腔積液的研究進展(英文)[J];Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2011年08期

  本文關鍵詞：人與鼠源內皮抑素基因合成和原核表達及功能驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：384852