本文關(guān)鍵詞：α7nAChR對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞促血管生成功能的影響及其機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的:多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是以骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆性增殖且腫瘤細(xì)胞與骨髓微環(huán)境密切聯(lián)系來(lái)支撐MM細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,為主要特征的一種惡性腫瘤。MM的發(fā)病率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%左右,MM具有侵襲性強(qiáng)、易耐藥和血管生成顯著等特點(diǎn),使絕大多數(shù)患者進(jìn)入難治或復(fù)發(fā)階段。因此對(duì)MM的治療提出新的挑戰(zhàn),也使其成為血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)。α7尼古丁乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR),是尼古丁乙酰膽堿受體的一個(gè)亞型。α7nAChR廣泛分布于中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng),近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞等細(xì)胞上也有表達(dá);其生物學(xué)功能也涉及到了認(rèn)知、炎癥調(diào)控、癌癥發(fā)展等多個(gè)方面。研究發(fā)現(xiàn)給予膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊可促進(jìn)缺血組織中的血管新生,使用α7nAChR抑制劑MG624可以抑制肺癌中的血管新生。有文獻(xiàn)報(bào)道,在MM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,血管生成具有十分重要的作用。2013白血病雜志也指出,骨髓瘤患者預(yù)后效果與血管生成關(guān)系密切,當(dāng)患者骨髓中新生血管顯著增多時(shí),患者一般預(yù)后較差。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的最重要的正向調(diào)控血管生成的細(xì)胞因子,在多種惡性腫瘤中高表達(dá),如胃癌,鼻咽癌及骨髓瘤等。且研究發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達(dá)可能與MM的血管生成及不良預(yù)后有關(guān)。源自于神經(jīng)外胚層及中胚層細(xì)胞的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)也是研究較多的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子之一。b FGF在多種惡性腫瘤中也存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象,可與VEGF協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。有研究指出血小板反應(yīng)素-1(Thrombospond1n-1,TSP-1)又稱為血小板反應(yīng)蛋白-1,是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑,主要由血小板,內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等分泌,可通過(guò)直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移以及拮抗VEGF來(lái)發(fā)揮抑制血管生成的作用。研究表明,TSP-1可作為前列腺癌,甲狀腺乳頭癌及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的輔助診斷指標(biāo)。目前關(guān)于α7nAChR與MM尚無(wú)研究報(bào)道。因此,本課題圍繞α7nAChR是否在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞促血管生成的過(guò)程中發(fā)揮作用開(kāi)展研究并探討其可能的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果:選取MM細(xì)胞株U266及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為主要的研究對(duì)象,并利用PNU-282987(α7nAChR的選擇性激動(dòng)劑)和MLA(α7nAChR的選擇性拮抗劑)為主要的研究藥物,利用細(xì)胞與細(xì)胞之間通過(guò)Transwell小室間接共培養(yǎng)方式來(lái)模擬骨髓微環(huán)境,進(jìn)而開(kāi)展研究。1.U266細(xì)胞表達(dá)α7nAChR利用Western blot檢測(cè)U266細(xì)胞中α7nAChR蛋白表達(dá),選取RAW264.7及HUVECs作為α7nAChR表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果提示,U266細(xì)胞也表達(dá)α7nAChR。激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)到U266細(xì)胞可被α7nAChR抗體(綠色熒光,主要分布在細(xì)胞膜)及DAPI(藍(lán)色熒光,主要分布在細(xì)胞核)共定位,也進(jìn)一步證明U266細(xì)胞表達(dá)α7nAChR。2.不同濃度的PNU-282987對(duì)U266細(xì)胞活力的影響采用CCK8檢測(cè)不同濃度的α7nAChR激動(dòng)劑PNU-282987(1,10,50μM)處理U266細(xì)胞6h后的細(xì)胞活力,發(fā)現(xiàn)50μM的PNU-282987使U266細(xì)胞活力下降;1μM和10μM的PNU-282987對(duì)U266細(xì)胞活性幾乎無(wú)影響。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取10μM的PNU-292987預(yù)處理U266細(xì)胞6h。3.不同濃度的MLA對(duì)U266細(xì)胞活力的影響采用CCK8檢測(cè)不同濃度α7nAChR拮抗劑MLA(100,200,300,400,500μM)處理U266細(xì)胞6h后的細(xì)胞活力,發(fā)現(xiàn)300μM,400μM及500μM的MLA使U266細(xì)胞活力下降;100μM和200μM的MLA對(duì)U266細(xì)胞活性影響不明顯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取200μM的MLA預(yù)處理U266細(xì)胞6h。4.PNU-282987對(duì)HUVECs細(xì)胞活力及小管生成能力的無(wú)明顯影響選用PNU-282987(10μM)預(yù)處理細(xì)胞24h,然后測(cè)定HUVECs的細(xì)胞活力及小管生成能力。發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.U266與HUVECs共培養(yǎng),測(cè)定HUVECs的小管生成能力選用PNU-282987(10μM),MLA(200μM),MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)預(yù)處理U266細(xì)胞6h后,去掉藥物,將其與預(yù)先鋪板的HUVECs共培養(yǎng),測(cè)定共培養(yǎng)24h后的HUVECs小管生成能力。結(jié)果表明,和單獨(dú)培養(yǎng)HUVECs相比,U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)后可提高其小管生成能力;使用PNU-282987預(yù)處理之后的U266細(xì)胞再與HUVECs共培養(yǎng),可使其促進(jìn)HUVECs的小管生成能力下降;使用α7nAChR的拮抗劑MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)預(yù)處理U266細(xì)胞后與HUVECs共培養(yǎng),能夠阻斷PNU-282987預(yù)處理U266導(dǎo)致的共培養(yǎng)后HUVECs小管生成能力下降的現(xiàn)象。另外使用MLA單獨(dú)或與PNU-282987聯(lián)合處理U266細(xì)胞6h后再將其與HUVECs共培養(yǎng),與U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)后的HUVECs的小管生成能力相比,其差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.PNU-282987激動(dòng)U266細(xì)胞的α7nAChR會(huì)降低共培養(yǎng)后HUVECs的小管生成能力,可能與b FGF的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)VEGF是主要的血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子,TSP-1是內(nèi)源性的抑制血管生長(zhǎng)因子。由前期結(jié)果可知,U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)24h后,可提高其小管生成能力;使用PNU-282987預(yù)處理U266細(xì)胞后,促HUVECs小管生成能力卻下降。這一現(xiàn)象說(shuō)明,U266細(xì)胞可能產(chǎn)生某些促血管生成因子或減少了抑制血管生成因子的釋放,經(jīng)PNU-282987預(yù)處理后,這一作用被抑制。為了探討可能的機(jī)制,我們首先選用ELISA檢測(cè)U266細(xì)胞經(jīng)PNU-282987(0,10μM)預(yù)處理6h及去掉藥物作用繼續(xù)培養(yǎng)24h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF及TSP-1的含量。結(jié)果表明,PNU-282987并不影響U266細(xì)胞分泌VEGF及TSP-1的水平。然后我們選用血管生成相關(guān)細(xì)胞因子抗體芯片(同時(shí)檢測(cè)20個(gè)血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子)對(duì)去掉PNU-282987(0,10μM)作用后繼續(xù)培養(yǎng)24h的U266細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PNU-282987預(yù)處理后可降低U266細(xì)胞分泌b FGF的水平。結(jié)論:α7nAChR參與了U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)的血管生成過(guò)程,PNU-282987激動(dòng)U266細(xì)胞的α7nAChR會(huì)降低共培養(yǎng)后HUVECs的小管生成能力,這一現(xiàn)象可能與U266細(xì)胞分泌的促血管生長(zhǎng)因子b FGF的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。研究背景及目的:多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是以骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆性增殖并伴有單克隆免疫球蛋白分泌為主要特征的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤。MM好發(fā)于老年人,隨著人口老齡化的加劇,MM的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì),放療與化療是治療MM的主要手段。地塞米松(dexamethasone,DEX)是糖皮質(zhì)激素類(lèi)衍生物,具有抗炎、抗休克、免疫抑制等藥理作用。近年來(lái),依照《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》指導(dǎo),DEX作為MM化療方案中的基礎(chǔ)藥物在臨床使用。氯喹(chloroquine,CQ)是治療瘧疾的經(jīng)典藥物,“老藥新用”是目前氯喹研究的新方向。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),CQ具有抗腫瘤的作用。Tang等研究表明CQ能夠增加吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞毒性;Han等發(fā)現(xiàn)CQ可以增加乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia induced factor 1,HIF-1)是一種在缺氧條件下普遍存在的異源二聚體核轉(zhuǎn)錄因子,有α及β亞單位組成,其中α亞單位決定其活性。與其他腫瘤不同的是,多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞處于相對(duì)密閉的缺氧骨髓微環(huán)境中,因此研究HIF-1α對(duì)于進(jìn)一步了解骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有十分重要的意義。B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)是抗凋亡家族的一員,是細(xì)胞凋亡通路中線粒體途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子,主要作用于線粒體外膜。染色體異位能夠誘導(dǎo)Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá),促使腫瘤的發(fā)生。故本課題針對(duì)CQ與DEX或輻射聯(lián)用后對(duì)MM細(xì)胞株U266的殺傷作用開(kāi)展研究,并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行初步探討。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果:選取MM細(xì)胞株U266為研究對(duì)象,CQ及DEX為研究藥物,60Co-γ線照射為輻射方式,進(jìn)而開(kāi)展研究。1.CQ及DEX均濃度依賴性地抑制U266細(xì)胞的增殖配制一系列濃度的CQ(終濃度為:1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0,1.0μM,2倍比稀釋)及DEX(終濃度為:2000,1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0μM,2倍比稀釋),選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U266細(xì)胞,接種于96孔板中。藥物處理U266細(xì)胞24h后,每孔加入10ul的CCK8檢測(cè)試劑,在450nm處檢測(cè)吸光度,計(jì)算細(xì)胞的增殖率(%)及抑制率(%)。結(jié)果顯示:CQ及DEX對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制作用均呈濃度依賴性,且CQ對(duì)U266細(xì)胞的半數(shù)致死濃度IC50約為77.9μM,DEX對(duì)U266細(xì)胞的IC50約為237.1μM。2.CQ增強(qiáng)化學(xué)藥物DEX對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制作用選用不同濃度的CQ(終濃度為:125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9μM)與DEX(終濃度為:250,125μM)聯(lián)用,并設(shè)置了相應(yīng)的單藥濃度組處理細(xì)胞。藥物作用24h后加入CCK-8試劑,檢測(cè)各孔的吸光度。利用中效原理軟件(Compusyn軟件),求出兩藥合用時(shí)的聯(lián)用指數(shù)(Combination index,CI)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)DEX濃度為125μM,CQ:DEX(c/c)在1:32~1:4時(shí),CI"f1,說(shuō)明兩藥協(xié)同或相加作用殺傷U266細(xì)胞;CQ:DEX(c/c)在1:2~1:1時(shí),CI1,說(shuō)明CQ與DEX聯(lián)用是拮抗作用。當(dāng)DEX濃度為250μM,CQ:DEX(c/c)在1:64~1:8時(shí),CI1,兩藥聯(lián)用后為協(xié)同作用;CQ:DEX(c/c)在1:4~1:2時(shí),CI"g1,兩藥聯(lián)用后為拮抗或相加作用。值得一提的是,DEX單藥濃度為125μM時(shí),對(duì)U266細(xì)胞的抑制率約為30%;CQ單藥濃度為7.8μM及3.9μM時(shí),細(xì)胞抑制率約為8%;但當(dāng)DEX與CQ聯(lián)用時(shí),細(xì)胞抑制率分別增加到了45%及36%,且此時(shí)兩藥的CI均1,表現(xiàn)為協(xié)同殺傷作用�？紤]到高濃度的DEX與低濃度的CQ聯(lián)用時(shí),DEX發(fā)揮主要的抑制細(xì)胞增殖作用,故我們將這一現(xiàn)象表述為CQ增強(qiáng)DEX對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用。3.不同輻射劑量對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用差異不明顯為了研究放療對(duì)MM細(xì)胞的殺傷作用,我們首先選取了不同的輻射劑量(5,10,15,20,5Gy)來(lái)照射U266細(xì)胞。與0Gy(對(duì)照組)相比,不同劑量的輻射使U266細(xì)胞的增殖能力下降,增殖率降為80%左右;但各組之間的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.CQ增敏輻射對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用細(xì)胞分組為:對(duì)照組,CQ組(1μM),輻射組(5Gy),輻射+CQ組。采用CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖率及凋亡率。結(jié)果表明:CQ單獨(dú)給藥對(duì)U266細(xì)胞的增殖及凋亡幾乎無(wú)影響;輻射后,U266細(xì)胞增殖能力下降,凋亡比例增加;給予CQ預(yù)處理后再進(jìn)行輻射,細(xì)胞的增殖率下降更明顯,凋亡程度增加地更顯著。5.CQ增強(qiáng)DEX對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用可能與Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)通過(guò)Western blot方法分別檢測(cè)了CQ與化學(xué)藥物DEX或輻射聯(lián)用后的細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示:CQ與DEX或輻射聯(lián)用并不影響U266細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá);U266細(xì)胞經(jīng)3.9μM的CQ處理后,Bcl-2蛋白水平無(wú)明顯變化;經(jīng)125μM的DEX處理后,胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)下降;當(dāng)兩藥合用后,Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降。提示,CQ增敏DEX對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用可能與抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)有關(guān)。但是,CQ預(yù)處理U266細(xì)胞后再輻射,檢測(cè)Bcl-2的表達(dá),其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:傳統(tǒng)抗瘧藥CQ能夠增強(qiáng)化學(xué)藥物DEX或輻射對(duì)于MM細(xì)胞U266的殺傷作用,且CQ增敏DEX殺傷U266細(xì)胞的機(jī)制可能與抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：α7尼古丁乙酰膽堿受體 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 血管生成 氯喹 地塞米松 輻射 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266 增敏
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 課題一 α7nAChR對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞促血管生成功能的影響及其機(jī)制研究 Role of α7nAChR in the angiogenesis induced by multiple myeloma cell5-47
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-28
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-38
• 討論38-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 課題二 氯喹增敏地塞米松或輻射對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用 Chloroquine sensitizes cytotoxic effects of dexamethasone or radiation on multiple myeloma cells47-77
• 摘要48-51
• Abstract51-54
• 縮略詞表54-55
• 前言55-57
• 材料和方法57-60
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-70
• 討論70-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 附錄77-78
• 綜述 Targeting α7 nicotinic acetylcholine receptor to combat inflammation In cardio-cerebral-vascular diseases78-92
• References86-92
• 碩士在讀期間發(fā)表論文和參加科研情況92-93
• 致謝93

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：363380