本文關鍵詞：人血中氨基酸及肉堿定量檢測和多肽藥物的質(zhì)量控制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遺傳性代謝病是由于基因突變導致體內(nèi)某種酶、運載蛋白、膜或受體的功能發(fā)生改變，使得機體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏，出現(xiàn)一系列臨床癥狀的一類疾病�；颊呷绻麤]有及時診斷和治療，將會損傷神經(jīng)系統(tǒng)，影響智力，引起昏迷甚至死亡。因此，開展遺傳性代謝病篩查是十分必要的。 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法篩查遺傳性代謝病能夠?qū)Χ鄠�代謝產(chǎn)物多種疾病進行同時檢測，具有靈敏度高、特異性強、分析速度快等特點，其假陽性率低、高通量的特性適合臨床上大規(guī)模的應用。本實驗擬通過利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立人體血液中內(nèi)源性代謝物氨基酸和�；鈮A的定量檢測方法，實現(xiàn)同時對氨基酸、有機酸、脂肪酸類代謝疾病的篩查，并研究不同年齡、地區(qū)是否對體內(nèi)氨基酸和酰基肉堿的含量有影響。 本研究建立了人體血液中10種氨基酸和32種�；鈮A類代謝物的檢測方法。用含有內(nèi)標的甲醇試劑提取干濾紙血片中的氨基酸和�；鈮A，經(jīng)鹽酸正丁醇衍生化以后，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行分析。其中大部分α-氨基酸采用中性丟失的掃描模式，丟失基團質(zhì)荷比為102.1Da；部分�；鈮A采用母離子掃描的模式，子離子質(zhì)荷比為85Da；其他氨基酸和�；鈮A采用多反應監(jiān)測的掃描模式。通過Masslynx軟件計算血樣中氨基酸和�；鈮A的含量。 這個方法能夠同時篩查13種氨基酸、13種有機酸以及11種脂肪酸類代謝疾病，當檢測到某種代謝物含量明顯超出或低于參考值范圍時，提示該人可能患有這類疾病。在篩查的205例血樣中沒有發(fā)現(xiàn)代謝異常的患者。另外，我們還利用靶標代謝組學的方法，針對年齡和地域因素，對44種檢測代謝物指標進行多元統(tǒng)計學分析。經(jīng)偏最小二乘判別分析找出差異代謝物，并結(jié)合T-檢驗，發(fā)現(xiàn)不同年齡人群氨基酸和�；鈮A含量不同。出生30天以上和30天內(nèi)的人群相比，體內(nèi)纈氨酸、瓜氨酸、游離肉堿含量明顯升高，而甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸、乙酰肉堿、鳥氨酸的含量降低，結(jié)果呈現(xiàn)年齡相關性，提示當進行不同年齡人群遺傳性代謝疾病篩查時應選擇適宜的參考值范圍。對于同一年齡段的高原同非高原人群，高原人群血液中甘氨酸和丙氨酸的含量較高，精氨酸的含量則相對較低，這可能同飲食生活習慣、高原缺氧等原因有關。這將可能為高原人群氨基酸的營養(yǎng)健康狀況評價依據(jù)。 多肽類藥物是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有易吸收、副作用小、生物活性強等特點，是藥物研究中一個重要領域。由于多肽主要由氨基酸組成，相對分子量較大，容易降解，因此在質(zhì)量控制方法有與一般的化學藥物不同的方面，除了參考一般化學藥物進行常規(guī)項目分析外，還應根據(jù)多肽的特點進行針對性研究。 艾塞那肽是一種人工合成的含有39個氨基酸的多肽類糖尿病治療藥物，為胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，對Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制有良好的效果，具有促進胰腺β細胞增殖和胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的釋放以及減緩胃排空、抑制食物攝取的作用。是近年來首個在全球范圍內(nèi)獲批的新型治療Ⅱ型糖尿病的藥物。 本研究擬通過對艾塞那肽的實驗研究，達到對其生產(chǎn)使用過程的質(zhì)量控制。根據(jù)中國藥典和合成多肽藥物藥學研究技術(shù)指導原則，結(jié)合艾塞那肽合成工藝，參考有關文獻，，對艾塞那肽的質(zhì)量控制方法進行系統(tǒng)研究。通過對艾塞那肽分析的探索，建立多肽類藥物質(zhì)量控制的相關檢測項目和方法，為多肽類藥物質(zhì)量標準的制定提供參考。 主要從純度、分子量、氨基酸序列、氨基酸組成、肽圖、等電點、紅外光譜、紫外光譜、有關物質(zhì)方面對艾塞那肽進行質(zhì)量控制分析。利用高效液相色譜測定艾塞那肽純度為99.63%。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜表明該化合物的相對分子量為4186.86Da，與理論計算分子量4186.60Da相比差2.6ppm。采用Edman降解和串聯(lián)質(zhì)譜的方法分別對艾塞那肽進行N端15個氨基酸分析和全序列分析，結(jié)果均與理論序列一致，證明不存在截短肽或修飾性肽鏈以及其它多肽。氨基酸組成分析的結(jié)果表明艾塞那肽氨基酸種類及組成含量與理論值相符，各種氨基酸摩爾百分含量的偏差小于1.5%。艾塞那肽的肽質(zhì)量指紋圖譜有4個特征肽段，各肽段分子量與理論值基本相同。等電點測定采用凝膠等電聚焦電泳和全柱成像毛細管等電聚焦電泳(Capillary Isoelectric Focusing-Whole Column ImagingDetection, CIEF-WCID)的方法，結(jié)果基本相同，但CIEF-WCID所需時間明顯較短。艾塞那肽的紫外和紅外光譜信息能夠表明樣品分子結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵、氨基肽鍵、酚羥基、甲基、亞甲基、苯基等基團。 研究中首次運用CIEF-WCID方法建立了艾塞那肽有關物質(zhì)的分析檢測方法。首先利用串聯(lián)質(zhì)譜對艾塞那肽合成過程中可能產(chǎn)生的有關物質(zhì)，即斷裂肽3-39、N端乙�；腁c-His、氧化肽Met14SO和斷裂肽10-39進行全序列分析，確證其結(jié)構(gòu)。然后考察CIEF-WCID方法的準確性和重復性，檢測三種多肽的等電點相對誤差不超過2%，日內(nèi)和日間精密度分別小于0.12%和0.24%，表明該方法具有良好的準確性和重復性。最后使用CIEF-WCID的方法對艾塞那肽及其有關物質(zhì)進行了分離分析，通過加入不同濃度和不同種類的增溶劑(尿素、甘油、蔗糖)、改變兩性電解質(zhì)范圍、更換兩性電解質(zhì)品牌的方式改善艾塞那肽和有關物質(zhì)的分離度，最終確定使用AES pH3-10和Sigma pH4-6的兩性電解質(zhì)對艾塞那肽樣品進行有關物質(zhì)檢測。該結(jié)果提示CIEF-WCID的方法可以用做對多肽的分離測定和質(zhì)量控制，為今后多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量研究提供一種新的技術(shù)手段。
【關鍵詞】：遺傳性代謝病 靶標代謝組學 艾塞那肽 質(zhì)量控制 全柱成像毛細管等電聚焦電泳
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R917
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-19
• 第一部分 人血中氨基酸及肉堿定量檢測19-33
• 1 實驗材料19-20
• 1.1 試劑和材料19
• 1.2 同位素內(nèi)標和濃度19-20
• 1.3 儀器20
• 2 實驗方法20-23
• 2.1 樣品采集20
• 2.2 工作液的配制20-21
• 2.3 樣品前處理方法21
• 2.4 液相方法21
• 2.5 質(zhì)譜方法21-22
• 2.6 方法精密度22
• 2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析22-23
• 3 實驗結(jié)果23-32
• 3.1 實驗條件優(yōu)化23-25
• 3.2 方法精密度25
• 3.3 檢測代謝疾病種類25-27
• 3.4 檢測結(jié)果27-29
• 3.5 結(jié)果分析29-32
• 4 小結(jié)32-33
• 第二部分 多肽藥物的質(zhì)量控制33-61
• 1 實驗材料33-34
• 1.1 試劑和材料33-34
• 1.2 儀器34
• 2 實驗方法34-38
• 2.1 純度34
• 2.2 分子量34
• 2.3 氨基酸序列分析34-35
• 2.4 氨基酸組成分析35
• 2.5 肽質(zhì)量指紋圖譜35-36
• 2.6 等電點36
• 2.7 紅外光譜36
• 2.8 紫外光譜36
• 2.9 有關物質(zhì)36-38
• 3 實驗結(jié)果38-58
• 3.1 純度38-39
• 3.2 分子量39
• 3.3 氨基酸序列分析39-43
• 3.4 氨基酸組成分析43-44
• 3.5 肽質(zhì)量指紋圖譜44-45
• 3.6 等電點45-47
• 3.7 紅外光譜47-48
• 3.8 紫外光譜48
• 3.9 有關物質(zhì)48-58
• 4 小結(jié)58-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-67
• 綜述：串聯(lián)質(zhì)譜法在新生兒遺傳代謝病篩查中的應用67-75
• 參考文獻72-75
• 論著：全柱成像毛細管等電聚焦電泳測定艾塞那肽等電點75-83
• 個人簡歷83-84
• 致謝84

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 艾婷;劉俐;;2010年西安地區(qū)高危嬰幼兒中遺傳代謝病篩查情況分析[J];中國兒童保健雜志;2012年03期

2 顧學范;葉軍;韓連書;;上海地區(qū)遺傳代謝病的新生兒篩查(英文)[J];臨床兒科雜志;2009年02期

3 顧學范,周建德,葉軍;上海地區(qū)新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的篩查[J];中華預防醫(yī)學雜志;2002年01期

  本文關鍵詞：人血中氨基酸及肉堿定量檢測和多肽藥物的質(zhì)量控制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：358779