本文關鍵詞：α-倒捻子素衍生物對神經干細胞分化的影響及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:在傳統(tǒng)觀念中,成年哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)是不可再生的,一旦出現(xiàn)神經元的損傷或者丟失將難以修復,也就是說幾乎不可能重建神經功能。直到上個世紀90年代,神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的發(fā)現(xiàn)徹底改變了損傷神經元不可修復的傳統(tǒng)觀念。另外,通過近幾年的研究發(fā)現(xiàn),各種腦損傷如腦部缺血、腦部創(chuàng)傷和癲癇等都會產生大量可溶性細胞損傷信號,這一信號激活了神經干細胞的新生,選擇性地補充了大腦皮層丟失的神經膠質和神經元,為這一類疾病的治療帶來希望。因此,有關神經干細胞的的增殖及其分化的調控機制隨即成為神經科學領域的研究熱點。α-倒捻子素(α-Mangostin)是從山竹的果皮中分離提取得到的一類酮類化合物,它具有廣泛的生物學、藥理學活性。并且,α-Mangostin的母核結構與他克林相似,故可推斷其衍生物對神經干細胞分化也有一定影響。通過前期的探索實驗,發(fā)現(xiàn)α-Mangostin的一些衍生物可以促進神經干細胞分化,如果能促進NSCs分化為神經元,則對臨床用藥具有重大意義。目的:本研究通過原代培養(yǎng)分離獲得神經干細胞,并探尋最適合的培養(yǎng)條件。在加入一系列α-倒捻子素衍生物后,利用流式細胞術檢測其分化為神經元的比例。同時利用蛋白印跡法(western blot)探究其分化的機制。方法:本研究內容分為三個部分:(1)建立原代培養(yǎng)神經干細胞的方法,分別以1×105個/ml,1×106個/ml,1×107個/ml的密度接種神經干細胞,通過比較找到合適的接種密度。再以機械傳代和胰酶傳代兩種方式進行傳代,比較神經干細胞后期生長情況以確定合適的傳代方式。在神經干細胞分化后利用免疫熒光法鑒定相應的細胞。(2)設立三個組:陰性對照組(不加抗體處理),不加藥組(只加1%胎牛血清),以及加入α-倒捻子素衍生物(100ng/ml)的實驗組。分化7天后加入NSE(1:100)抗體進特異性染色,利用流式細胞儀檢測其分化為神經元的比例。(3)選擇前期實驗分化效果最好的一個α-倒捻子素衍生物干預神經干細胞分化,利用蛋白印跡法(western blot)檢測干預0,3,5,7,9天后的Axin,β-catenin,Wnt-1,Cyclin D1和Notch-1的蛋白表達。初步探究神經干細胞分化的機制。結果:(1)1×105個/ml接種的神經干細胞大多增殖克隆形成較小團狀,只有少數(shù)形成小型神經球。1×106個/ml接種的神經干細胞能很好地形成大小合適的神經球。1×107個/ml接種的神經干細胞由于細胞過于密集,形成的神經球過大,神經球中心細胞死亡,且容易貼壁分化。另外,胰酶傳代的方式相對機械傳代,對細胞損傷更小,第二代神經干細胞狀態(tài)更好。(2)在流式細胞儀檢測結果中,與陰性對照組相比,不加藥組和實驗組的信號都發(fā)生右移。各α-倒捻子素衍生物對神經干細胞的分化均有一定影響,其中以A-GM2在100ng/ml濃度下提高比例最大,由不加藥分化的22%提高到約37%,效果顯著。(3)通過WB發(fā)現(xiàn)Wnt-1在分化前期大量增加,后期減少。Axin在整個分化過程中逐漸減少,在未分化的神經干細胞中含量最高。Axin的減少抑制了β-catenin磷酸化降解,使β-catenin在整個分化過程中含量逐漸增加。β-catenin的增加激活了Wnt信號相關靶基因轉錄,其下游蛋白Cyclin D1表達增加,同時抑制了Notch-1的表達。結論:(1)1×106個/ml的接種密度以及胰酶傳代的方法為最合適的神經干細胞培養(yǎng)條件。(2)α-倒捻子素衍生物有調控神經干細胞分化的功能,對神經干細胞分化為神經元有不同程度的調控作用。(3)Wnt/β-catenin經典信號通路中,通過高表達的Wnt-1與其他蛋白的結合激活了散亂蛋白Dvl,Dvl在細胞內拮抗由蛋白CKI,GSK-3β,Axin和APC所組成的β-catenin降解復合物的活性。導致β-catenin不能通過磷酸化降解。β-catenin的增加激發(fā)了Wnt-1相關靶基因的轉錄,其下游蛋白Cyclin D1表達逐漸增加,從而促進細胞分化。在整個分化過程中Wnt/β-catenin通路與Notch信號通路相互作用,且Notch-1起負調控作用。
【關鍵詞】：α-倒捻子素衍生物 神經干細胞 神經元 Wnt/β-catenin Notch-1
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 縮略詞表14-16
• 第一章 緒論16-26
• 1.1 國內外關于本課題的研究進展16-19
• 1.1.1 α-倒捻子素研究進展16-18
• 1.1.2 神經干細胞及其分化研究進展18-19
• 1.2 Nestin,NSE,GFAP與神經干細胞的分化19
• 1.3 流式細胞術在細胞檢測中的應用19-20
• 1.4 Wnt/β-catenin信號通路20-21
• 1.5 Notch信號通路21-22
• 1.6 α-倒捻子素衍生物的合成方法22-24
• 1.7 本課題選題及研究意義24-26
• 第二章 神經干細胞的原代培養(yǎng)及鑒定26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 實驗材料及方法26-30
• 2.2.1 藥品試劑及儀器26-27
• 2.2.2 溶液的制備27
• 2.2.3 神經干細胞原代培養(yǎng)27-28
• 2.2.4 細胞接種密度探究方法28-29
• 2.2.5 神經干細胞傳代方法29
• 2.2.6 免疫熒光法29-30
• 2.3 實驗結果30-35
• 2.3.1 原代培養(yǎng)神經干細胞的形態(tài)30-31
• 2.3.2 不同接種密度對神經干細胞生長的影響31-33
• 2.3.3 不同傳代方式對神經干細胞生長的影響33-34
• 2.3.4 免疫熒光鑒定結果34-35
• 2.3.5 神經干細胞凍存結果35
• 2.4 討論35-37
• 第三章 α-倒捻子素衍生物對神經干細胞分化的影響37-46
• 3.1 引言37
• 3.2 實驗材料及方法37-40
• 3.2.1 藥品試劑及儀器37-38
• 3.2.2 主要溶液配制38
• 3.2.3 不同血清濃度對神經干細胞分化的影響38
• 3.2.4 機械吹打對神經干細胞分化的影響38-39
• 3.2.5 神經干細胞分化實驗39
• 3.2.6 神經元細胞鑒定39
• 3.2.7 流式細胞儀檢測神經元比例39-40
• 3.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計40
• 3.3 實驗結果40-44
• 3.3.1 不同濃度的血清對神經干細胞分化的影響40-41
• 3.3.2 機械吹打對神經干細胞分化的影響41-42
• 3.3.3 流式細胞實驗結果42-44
• 3.3.4 免疫熒光結果44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 神經干細胞分化機制的研究46-55
• 4.1 引言46
• 4.2 材料和方法46-51
• 4.2.1 實驗藥品和儀器46-47
• 4.2.2 溶液配制47-48
• 4.2.3 蛋白質提取48-49
• 4.2.4 蛋白印跡法49-50
• 4.2.5 制膠方法50-51
• 4.3 實驗結果51-53
• 4.3.1 Notch-1 蛋白表達結果51
• 4.3.2 β-catenin蛋白表達結果51
• 4.3.3 Wnt-1 蛋白表達結果51-52
• 4.3.4 Axin蛋白表達結果52
• 4.3.5 Cyclin D1蛋白表達結果52-53
• 4.4 討論53-55
• 總結與展望55-56
• 參考文獻56-61
• 致謝61-62
• 碩士期間已發(fā)表和待發(fā)表的學術論文62

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