發(fā)布時間：2017-04-20 17:25

  本文關(guān)鍵詞：三氯生通過誘導自噬加強巨噬細胞清除胞內(nèi)寄生菌機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自噬是真核生物進化中高度保守的細胞內(nèi)過程,其功能是降解和回收細胞內(nèi)大分子物質(zhì)和受損細胞器。自噬不僅能以非選擇性的方式降解底物,還能以選擇性的方式清除細胞內(nèi)的物質(zhì)。因此,選擇性自噬在對抗病原微生物的過程中扮演了重要的角色,是宿主細胞重要的免疫應答反應。這個既保守又復雜的過程需要完善的調(diào)控機制來支撐,已有超過36種自噬相關(guān)基因(Autophagy-related gene,ATG)在酵母細胞中被發(fā)現(xiàn),其表達的蛋白常常以形成復合物的形式參與自噬過程的調(diào)控,此外,越來越多的自噬通路正在被人們所發(fā)現(xiàn)。三氯生是一種廣譜抗菌劑,具有抗大多數(shù)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性無芽孢菌、一些真菌、瘧原蟲和弓形蟲的作用。至今,已經(jīng)揭示的三氯生抗菌機制為“其通過抑制病原菌脂肪酸合成過程中起關(guān)鍵作用的脂肪酸合成酶II型(FAS II)的活性達到抗菌效果”。三氯生通過該作用機制不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,因此被添加在多種消毒劑和洗護用品中,并且目前已有三氯生成功治療小鼠系統(tǒng)性細菌感染的研究報道�；谏鲜鋈壬咕膹V譜性和自噬在抗病原微生物中的作用,在本研究中,我們以巨噬細胞RAW264.7為模式細胞,結(jié)合體內(nèi)實驗,探究三氯生能否通過誘導自噬加強巨噬細胞清除胞內(nèi)寄生菌,并考察其作用機制。首先,我們利用熒光顯微鏡對經(jīng)三氯生作用的He La細胞表達GFP-LC3的水平進行觀察;利用透射電鏡對三氯生作用的RAW264.7細胞中的自噬體進行觀察;利用western blot技術(shù)對RAW264.7細胞的LC3表達水平進行檢測;利用western blot技術(shù)對三氯生作用的小鼠肝臟、脾臟內(nèi)LC3表達水平進行檢測;對He La細胞GFP-LC3、RFP-LC3的表達情況進行熒光顯微鏡觀察;對三氯生和氯喹(CQ)處理的RAW264.7細胞中LC3表達水平進行比較。結(jié)果表明:三氯生可誘導He La細胞中GFP-LC3斑點增多以及RAW264.7細胞中自噬體增加;三氯生誘導RAW264.7細胞、小鼠肝臟、小鼠脾臟中LC3-II/LC3-I的值增加;三氯生誘導He La細胞中GFP-LC3、RFP-LC3斑點增多,且后者多于前者;三氯生作用過程中的LC3降解過程能被CQ抑制。其次,我們利用western blot技術(shù)分別檢測了不同濃度三氯生作用不同時間的RAW264.7細胞內(nèi)m TOR、p70S6K、4E-BP1、AMPK-α、AMPK-β、ULK1、ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平;利用western blot技術(shù)分別檢測抑制劑PD98059、SB203580、SP600125預處理三氯生作用細胞的ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平以及LC3的表達水平。結(jié)果表明:三氯生不能抑制m TOR、p70S6K、4E-BP1的磷酸化;三氯生能誘導AMPK-α、AMPK-β、ULK1、ERK、JNK、p38的磷酸化;SP600125可抑制三氯生誘導的ERK、JNK、p38的磷酸化,SB203580可抑制三氯生誘導的ERK、p38的磷酸化,PD98059可抑制三氯生誘導的ERK的磷酸化。最后,我們利用激光共聚焦顯微鏡觀察沙門氏菌、白色念珠菌及其分別加入三氯生之后作用于RAW264.7細胞的p62、NDP52、LC3蛋白的表達水平和共定位水平;利用菌落計數(shù)對三氯生是否體外能加強RAW264.7細胞吞噬、殺傷能力進行評價;利用菌落計數(shù)對三氯生是否能體內(nèi)加強小鼠沙門氏菌感染模型和白色念珠菌感染模型中殺菌能力進行評價。結(jié)果表明:三氯生能誘導p62、NDP52的表達以及能加強p62、NDP52與菌的共定位;三氯生體外能夠加強RAW264.7細胞對沙門氏菌、白色念珠菌的吞噬和清除;三氯生體內(nèi)能夠加強小鼠沙門氏菌感染模型和白色念珠菌感染模型中對病原菌的清除�？傊�,本研究結(jié)果表明,三氯生能通過激活AMPK/ULK1和JNK/ERK/p38途徑的磷酸化而非抑制m TOR途徑的磷酸化誘導自噬的發(fā)生,并且通過這一作用機制加強了巨噬細胞對胞內(nèi)菌的清除。本研究豐富了三氯生的抗菌機制,為以三氯生為先導化合物的抗系統(tǒng)性細菌感染藥物開發(fā)及以自噬為藥靶的抗菌新藥發(fā)現(xiàn)打下實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：三氯生 巨噬細胞 自噬 殺菌 機制
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文獻綜述13-31
• 第一章 三氯生的藥理作用及應用研究進展13-18
• 1.1 三氯生概述13-14
• 1.2 三氯生的抗菌機制14-16
• 1.3 三氯生的應用16-18
• 第二章 細胞自噬研究進展18-29
• 2.1 概述18
• 2.2 自噬的分類18-21
• 2.3 自噬的發(fā)生過程21-22
• 2.4 自噬的通路及調(diào)控22-26
• 2.5 自噬的生物學作用26-29
• 第三章 巨噬細胞研究進展29-31
• 3.1 巨噬細胞概述29
• 3.2 巨噬細胞抗菌機制29-31
• 第二篇 研究內(nèi)容31-65
• 第一章 三氯生誘導巨噬細胞自噬31-46
• 1.1 實驗材料31-33
• 1.2 實驗方法33-38
• 1.3 實驗結(jié)果38-43
• 1.4 討論43-45
• 1.5 小結(jié)45-46
• 第二章 三氯生誘導巨噬細胞自噬的機制研究46-54
• 2.1 實驗材料46-47
• 2.2 實驗方法47
• 2.3 實驗結(jié)果47-51
• 2.4 討論51-53
• 2.5 小結(jié)53-54
• 第三章 三氯生通過誘導自噬加強巨噬細胞胞內(nèi)菌清除54-65
• 3.1 實驗材料54-55
• 3.2 實驗方法55-58
• 3.3 實驗結(jié)果58-63
• 3.4 討論63-64
• 3.5 小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻66-75
• 導師簡介75-76
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果76-77
• 致謝77

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