本文關(guān)鍵詞：以中鏈脂肪酸受體GPR84為靶點的藥物高通量篩選模型的建立和應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)是C9-C14的中鏈脂肪酸受體,不僅在脂肪酸代謝和機體免疫反應發(fā)揮著重要作用,而且與腸炎、多發(fā)性硬化癥、內(nèi)毒素血癥等炎癥性免疫疾病有著密切聯(lián)系。由于GPR84是一種促進炎癥發(fā)生的受體,因此,找到以GPR84為靶點的拮抗劑,可能為治療這些疾病提供一種有效的方法。迄今為止針對G蛋白偶聯(lián)受體常用的藥物篩選方法有兩種,一種是針對受體的配體競爭結(jié)合實驗,另外一種是依賴于GPCR下游信號通路(如cAMP, Ca2+)的功能性實驗。在GPCR激活后,可以活化Gαq亞基中的Gα16,通過一系列的信號轉(zhuǎn)導后,可以升高胞內(nèi)肌醇三磷酸(IP3)的濃度,繼而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子釋放,通過檢測胞質(zhì)中鈣離子濃度的變化,可以推斷出受體被激活的水平。本文將含GPR84和Gα16基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中,經(jīng)過抗生素抗性篩選,挑取穩(wěn)定表達GPR84蛋白的HEK293細胞系。用RT-PCR、免疫熒光染色等實驗方法檢測了GPR84基因和其編碼受體蛋白的表達；用鈣流實驗、cAMP實驗、Western blot實驗、FACS實驗證實了表達的GPR84具有完整的生物學活性,并利用該細胞系進行了藥物高通量篩,得到了新的GPR84拮抗劑,為進一步闡明GPR84的生物學功能,研究并治療與其相關(guān)免疫疾病奠定了基礎(chǔ)。建立HEK293/GPR84/ Gα16穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。方法：將編碼GPR84和Gα16蛋白的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至HEK293細胞之中,利用抗生素抗性篩選28天,選擇穩(wěn)定生長的單克隆擴大培養(yǎng),得到單克隆之后,利用RT-PCR和免疫熒光染色的實驗方法檢測了外源基因和表達的受體蛋白,結(jié)果：RT-PCR和免疫熒光染色均檢測到GPR84蛋白的表達,證明獲得的細胞系膜表面穩(wěn)定表達GPR84受體。檢測獲得的HEK293/GPR84/Gα16穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系上GPR84活性及功能。方法：利用鈣流實驗、cAMP實驗和Western blot實驗的方法檢測GPR84的配體6-OAU對本細胞株上穩(wěn)定表達的GPR84具有激動作用；利用鈣流實驗、FACS實驗和免疫熒光染色實驗檢測了在6-OAU刺激后,本細胞株膜表面上的GPR84受體脫敏,并發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象。結(jié)果：GPR84能被6-OAU呈劑量依賴性地激活,說明建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系膜表面上的GPR84具有完整的生物學功能。建立高通量鈣流篩選模型及其應用。方法：(1)高通量鈣流模型分為兩種模型：激動劑模型及拮抗劑模型,即可分別評價6-OAU和小分子化合物對GPR84受體的作用；(2)應用拮抗劑模型檢測了國家化合物樣品庫中的一系列化合物對GPR84的作用。結(jié)果：6-OAU能劑量依賴地激活趨化因子受體GPR84,在激動劑模型中檢測到顯著的鈣離子變化信號,而應用拮抗劑模型,篩選小分子化合物能否抑制6-OAU引起的鈣離子變化,初步得到了對趨化因子受體GPR84有一定拮抗作用的化合物ZQ-02,并驗證了該化合物對GPR84的拮抗活性和特異性。
【關(guān)鍵詞】：GPR84 G蛋白偶聯(lián)受體 穩(wěn)定表達 拮抗劑 鈣流實驗 高通量篩
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 G蛋白偶聯(lián)受體12-16
• 1.1.1 GPCRs的結(jié)構(gòu)與分類12-13
• 1.1.2 基于GPCRs的信號傳導系統(tǒng)13-16
• 1.1.3 以G蛋白偶聯(lián)受體為靶點的藥物開發(fā)以及市場前景16
• 1.2 中鏈脂肪酸受體GPR84概述16-21
• 1.2.1 游離脂肪酸受體及其分類16-17
• 1.2.2 GPR84的功能及其配體17-19
• 1.2.3 GPR84與疾病19-21
• 第二章 研究目的與內(nèi)容21-23
• 2.1 研究目的21
• 2.2 研究內(nèi)容21-23
• 第三章 材料與方法23-35
• 3.1 實驗材料23-30
• 3.1.1 質(zhì)粒和細胞株23
• 3.1.2 試劑及耗材23-24
• 3.1.3 儀器24-26
• 3.1.4 試劑配制26-30
• 3.2 實驗方法30-35
• 3.2.1 細胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建30
• 3.2.2 RT-PCR30-31
• 3.2.3 鈣流實驗31
• 3.2.4 環(huán)腺苷酸(cAMP)實驗31-32
• 3.2.5 免疫熒光染色32
• 3.2.6 流式細胞分析(FACS)32
• 3.2.7 Western blot檢測ERK磷酸化水平32-33
• 3.2.8 GPR84拮抗劑的高通量篩選33-34
• 3.2.9 數(shù)據(jù)處理及分析34-35
• 第四章 結(jié)果與分析35-44
• 4.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達GPR84/Gα16蛋白的HEK293細胞株35
• 4.2 GPR84基因表達及其受體蛋白定位35-36
• 4.3 6-OAU提高GPR84介導的細胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)濃度36
• 4.4 6-OAU通過GPR84降低細胞內(nèi)cAMP水平36-37
• 4.5 6-OAU通過激活GPR84導致ERK磷酸化37-38
• 4.6 6-OAU誘導GPR84發(fā)生脫敏現(xiàn)象38-39
• 4.7 6-OAU誘導GPR84發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象39-40
• 4.8 GPR84拮抗劑的高通量篩選(初篩)40-41
• 4.9 GPR84拮抗劑的復篩及其活性驗證41-44
• 第五章 結(jié)論及意義44-46
• 參考文獻46-49
• 在學期間所取得的科研成果49-50
• 致謝50

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 羅弟祥,何耀,高小平,張義正;蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制劑高通量篩選模型建立和應用[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2005年05期

2 李林;李國;陳莉莉;羅海斌;陳靜;沈旭;梅長林;;表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑高通量篩選模型的建立[J];第二軍醫(yī)大學學報;2009年12期

3 熊小椒;周爽;楊延輝;關(guān)艷;肖春玲;;以次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶為靶點的新型抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立及應用[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2011年06期

4 王斯文;陳向東;汪輝;石功名;郭欣;張序磊;;β-內(nèi)酰胺酶抑制劑高通量篩選模型的建立[J];中國抗生素雜志;2013年02期

5 朱深銀;周遠大;劉慶山;杜冠華;;黃嘌呤氧化酶抑制劑高通量篩選模型的建立及應用[J];中國藥學雜志;2007年03期

6 孟鵬;齊西珍;鄭芳;任麗梅;白芳;白鋼;;α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型的建立及其應用[J];微生物學報;2010年08期

7 唐先兵,司書毅,張月琴;以大腸埃希氏菌肽脫甲�；笧榘悬c的高通量篩選模型的建立(英文)[J];中國抗生素雜志;2003年10期

8 柳軍;牛蕤;張陸勇;;糖原磷酸化酶抑制劑高通量篩選模型的建立[J];中國新藥雜志;2007年06期

9 李健蕊;武燕彬;司書毅;陳鴻珊;蔣建東;彭宗根;;丙型肝炎病毒蛋白酶抑制劑高通量篩選模型的建立及應用[J];中國醫(yī)學科學院學報;2011年01期

10 劉媛;董志;肖曉秋;唐紅;王樂樂;程玉潔;;人二型大麻受體激動劑高通量篩選模型的建立[J];細胞與分子免疫學雜志;2012年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭晶;王夙博;袁天翊;方蓮花;杜冠華;;蛋白酪氨酸激酶抑制劑高通量篩選模型的建立和應用[A];第十三屆中國科協(xié)年會生物醫(yī)藥博士論壇論文集[C];2011年

2 王臻;高茜;李曉宇;岑山;;以甲型流感病毒基因組轉(zhuǎn)錄復制為靶點的抗流感藥物高通量篩選模型的建立[A];第十二屆全國抗生素學術(shù)會議論文集[C];2013年

3 柏冰;謝建平;晏菊芳;王洪海;胡昌華;;異檸檬酸裂解酶抑制劑的高通量篩選模型的建立及其應用[A];2006第六屆中國藥學會學術(shù)年會論文集[C];2006年

4 孫立;袁勝濤;施偉;張陸勇;;組織因子高通量篩選模型的建立[A];2007醫(yī)學前沿論壇暨第十屆全國腫瘤藥理與化療學術(shù)會議論文集[C];2007年

5 鄭旭光;陳曉光;;P53蛋白高通量篩選模型的建立及應用[A];第八屆全國生化藥理學術(shù)討論會暨第七屆Servier獎頒獎大會會議摘要集[C];2003年

6 王守寶;宋俊科;孫加琳;杜冠華;;CYP450表氧化酶激活劑高通量篩選模型的建立[A];合理用藥及新藥評價專題研討會日程安排與論文摘要[C];2010年

7 彭健豪;杜冠華;;ADAMTS1抑制劑高通量篩選模型的建立和應用[A];藥學發(fā)展前沿論壇及藥理學博士論壇論文集[C];2008年

8 賈曉健;王麗;洪斌;;以人HDL受體SR-BI mRNA穩(wěn)定性為靶點的新型心血管藥物高通量篩選模型的建立和應用[A];第四屆全國微生物資源學術(shù)暨國家微生物資源平臺運行服務研討會論文集[C];2012年

9 殷瑜;李素秋;戈梅;陳代杰;錢秀萍;;反義RNA介導的MurA抑制劑高通量篩選模型的構(gòu)建及驗證[A];第十二屆全國抗生素學術(shù)會議論文集[C];2013年

10 王守寶;郭晶;祖勉;周丹;楊海光;杜冠華;;人源可溶性環(huán)氧化物水解酶(hsEH)抑制劑高通量篩選模型建立及其應用[A];中國藥理學會第十次全國學術(shù)會議專刊[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳凱;我新藥和高通量篩選技術(shù)成功應用[N];經(jīng)濟日報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鄭旭煦;Neuromedin U2受體激動劑高通量篩選模型與天然產(chǎn)物活性成分研究[D];重慶大學;2003年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 龐濤;人源—磷酸腺苷激活蛋白激酶（HsAMPK）調(diào)節(jié)劑分子水平高通量篩選模型的建立[D];華東師范大學;2004年

2 毛偉峰;人源糖原合成酶激酶-3β（Human Glycogen Synthase Kinase-3β）的性質(zhì)研究及其抑制劑的高通量篩選模型建立[D];華東師范大學;2004年

3 郎廷元;MDR逆轉(zhuǎn)劑高通量篩選模型的建立和應用[D];西南大學;2007年

4 趙遠勝;人源DPPIV抑制劑高通量篩選模型的建立和新型抑制劑的發(fā)現(xiàn)[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2005年

5 朱京童;5-脂氧化酶抑制劑高通量篩選模型的建立及應用[D];天津大學;2010年

6 步洪強;結(jié)核分枝桿菌DXS和DXR抑制劑高通量篩選模型的建立與應用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

7 張慶;以中鏈脂肪酸受體GPR84為靶點的藥物高通量篩選模型的建立和應用[D];華東師范大學;2015年

  本文關(guān)鍵詞：以中鏈脂肪酸受體GPR84為靶點的藥物高通量篩選模型的建立和應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：315723