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微生物學(xué)通報(bào) Microbiology
tongbao@im.ac.cn

JAN 20, 2009, 36(1): 97~105 ? 2009 by Institute of Microbiology, CAS

專論與綜述

抗菌肽的抗菌機(jī)制及其臨床應(yīng)用
侯曉姝 胡宗利 陳國(guó)平* 李 勇 王炳琴

李梔恩
(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶 400030)

摘

要: 抗菌肽是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種小分子肽, 具有廣譜性、高效性、穩(wěn)定性等特點(diǎn), 其

本身不易產(chǎn)生耐藥性。不僅具有殺菌作用, 還能抑殺真菌、寄生蟲(chóng)、病毒以及腫瘤細(xì)胞且對(duì)正常 細(xì)胞毒性較小。新穎抗生素發(fā)現(xiàn)的缺乏, 導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn), 抗菌肽有可能成為一種新 的抗生素替代品。本文介紹了抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物活性, 并重點(diǎn)闡述了其抗菌機(jī)制及最新臨 床應(yīng)用進(jìn)展。 關(guān)鍵詞: 抗菌肽, 抗菌機(jī)制, 臨床應(yīng)用

Antimicrobial Peptides: Antibacterial Mechanism and Therapeutic Use
HOU Xiao-Shu HU Zong-Li CHEN Guo-Ping* LI Yong WANG Bing-Qin LI Zhi-En
(Bioengineering College of ChongQing University, Chongqing 400030, China)

Abstract: Antimicrobial peptides, a cluster of small peptides secreted by the majority of creatures, have been demonstrated with activity against a wide range of microorganisms including bacteria, protozoa, yeast, fungi, viruses and even tumor cells. These peptides have some features such as broad spectrum , high efficacy and stability, little drug resistance. A lack of new antibiotics combined with emerging multi-drug resistance issues demands that new antimicrobial strategies be explored for treating these infections. It has been proposed that the antimicrobial peptides might form the foundation for a new class of clinically useful antimicrobials. We review the advantages of these molecules in construction features and bioactivity, with the focus on the mechanism and clinical applications. Keywords: Antibacterial peptides, Mechanism of antibiosis, Clinical application 近年來(lái), 在臨床治療中結(jié)構(gòu)新穎的抗生素發(fā)現(xiàn) 匱乏, 在過(guò)去的四十幾年中僅有 3 類新的抗生素藥 出現(xiàn), lipopeptides, oxazolidinones 和 streptogramins, 且這幾種均針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 。新的治療革蘭 氏陰性菌抗生素的缺乏導(dǎo)致抗藥菌群迅猛發(fā)展, 使 某些感染性疾病成為臨床治療的難題, 因此新的抗 菌策略問(wèn)題急待解決。 抗菌肽(Antibacterial peptides)
[1]

是天然免疫的主要成分, 具有廣譜性、高效性、選 擇毒性、穩(wěn)定性及不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn), 自發(fā)現(xiàn) 和研究至今被認(rèn)為是現(xiàn)有抗生素的最佳替代品, 其 研究及應(yīng)用已成為生物制藥領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。目前不 同類型的抗菌肽已從各種生物包括細(xì)菌、真菌、植 物、昆蟲(chóng)、兩棲類動(dòng)物、魚(yú)類、鳥(niǎo)類、哺乳類動(dòng)物 和人體中分離出來(lái)并得到鑒定�？咕拇砹艘环N

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30600044, No. 30771463); 國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2006AA02Z138) * 通訊作者：Tel: 023-65112674; : chenguoping@cqu.edu.cn 收稿日期：2008-06-26; 接受日期：2008-10-15

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新的抗生素替代品, 引起了廣泛的研究興趣, 有望 成為治療耐藥性抗藥細(xì)菌的一個(gè)方法。本文結(jié)合近 年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道, 介紹了抗菌肽的結(jié)構(gòu)特 點(diǎn)、生物活性并重點(diǎn)闡述了其抗菌機(jī)制及臨床應(yīng)用 情況。

defensins 可以增強(qiáng)或抑制細(xì)胞內(nèi)功能如趨化性、編 程性細(xì)胞死亡、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞因子生產(chǎn)等 [10]。 3) 免疫激活：感染或損傷處所分泌的 Cathelicidins 和 defensins 對(duì)效應(yīng)細(xì)胞具有趨化性, 誘導(dǎo)化學(xué)激活 素的轉(zhuǎn)錄及分泌和肥大細(xì)胞的組胺釋放, 這些反應(yīng) 一起則能促進(jìn)先天的及獲得性免疫細(xì)胞的補(bǔ)充 [11]。 4) 炎性及免疫抑制：哺乳動(dòng)物抗菌肽除了具有促炎 性反應(yīng)外, 也能阻止有害的炎癥應(yīng)答。Cathelicidins 能夠抑制致炎細(xì)胞因子如 TNF-α 和 IL-6 的相關(guān)基因 轉(zhuǎn)錄、促炎癥反應(yīng)物質(zhì)的釋放及避免細(xì)菌感染后嚙 齒類的膿毒癥, 還能防止引起阻止損傷和炎癥的毒 性組分的產(chǎn)生, 如 PR-39 抑制活性氧簇的生成。5) 免疫增強(qiáng)：抗菌肽可以通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能 和抗原特異性免疫應(yīng)答而作用于先天及獲得性免疫 界面 [12]。LL-37 能夠誘導(dǎo)初期的單核細(xì)胞衍生的樹(shù) 突狀細(xì)胞的分化, 增加細(xì)胞內(nèi)吞能力, 調(diào)節(jié)吞噬細(xì) 胞受體的表達(dá)和功能, 同時(shí)上調(diào) CD86 的表達(dá)及增 加 Th1 細(xì)胞因子的分泌作用 [13]。

1

抗菌肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與生物活性
抗菌肽一般由小于 100 個(gè)氨基酸殘基組成, 存

在很多賴氨酸、精氨酸及大于 30%的疏水性氨基酸, 大多帶有一定量的正電荷�？咕牡募易宄蓡T十分 龐大, 目前已經(jīng)有超過(guò) 900 種的抗菌肽被從各種生 物中分離鑒定出來(lái)。由抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以將其 分為 4 種種類：(1)帶有 α 螺旋結(jié)構(gòu)的線性肽如 cecropin A[2]、magainin[3]; (2)β 折疊肽如植物防御素 γ-2-purothionin 、hepcidin ; (3)具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的肽 如 subtilosin A[6]; (4)線形肽, 該類型抗菌肽通常帶 有一個(gè)或多個(gè)占主導(dǎo)地位的氨基酸, 如從牛的嗜中 性細(xì)胞里分離出來(lái)的 indolicidin 由 13 個(gè)氨基酸殘 基組成, 其中就含有 5 個(gè)色氨酸 [7]。前 2 種類型是 自然中最常見(jiàn)的抗菌肽類型。還有一些肽并不具有 以上單一的結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)較為新穎, 人類 β defensin 2 既具有α螺旋也有 β 折疊結(jié)構(gòu) [8]。 從海洋兩棲動(dòng)物 中以螃蟹為食的蛙 Rana cancrivora 皮膚中首次分離 得 到 一 種 抗 菌 肽 cancrin, 氨 基 酸 序 列 為 GSAQPYKQLHKVVNWDPYG, 分析發(fā)現(xiàn)其一級(jí)結(jié) 構(gòu)與已有的抗菌肽無(wú)相似性, 不能簡(jiǎn)單將其劃分為 以上的任何一類抗菌肽 [9] 。除了天然存在的抗菌肽 之外, 還存在著許多人工合成的抗菌肽異構(gòu)體, 現(xiàn) 在已經(jīng)有許多專門(mén)收錄各種抗菌肽的數(shù)據(jù)庫(kù), 如 APD 數(shù) 據(jù) 庫(kù) ： , ANTIMIC 數(shù) 據(jù) 庫(kù) ： Templar/DB/ANTIMIC/。 抗菌肽的活性與許多因素有關(guān), 包括抗菌肽的 大小、序列、電荷、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、疏水性及雙親性 等, 其生物功能可以分為幾個(gè)方面：1) 直接殺菌作 用：抗菌肽除了能殺滅革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性 菌外, 對(duì)病毒、寄生蟲(chóng)、真菌也具有活性。2) 免疫 系統(tǒng)調(diào)節(jié)物：最近許多研究認(rèn)為在生理性環(huán)境里, 在先天免疫細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞及上皮細(xì)胞)和連接 先天免疫及獲得性免疫的細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞、樹(shù)狀突細(xì)胞)中, 抗菌肽激發(fā)了一系列與炎癥、 先天免疫及獲得性免疫有關(guān)的生物效應(yīng)。哺乳動(dòng)物

[4] [5]

2

抗菌肽抗菌機(jī)制
抗菌肽能夠選擇性抑制細(xì)菌生長(zhǎng)并殺死細(xì)菌,

細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)富含像磷脂酰甘油、心肌磷脂或絲 氨酸磷脂之類的磷脂首基而帶有負(fù)電荷。與之相反, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜則主要由兩性離子磷脂如腦磷酯、 磷酸卵磷酯、鞘磷脂等組成, 此外哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜 中還有一個(gè)重要的成分膽固醇, 可以與抗菌肽相結(jié) 合并降低其活性, 因此細(xì)胞膜成分的不同是抗菌肽 選擇性殺傷細(xì)菌的一個(gè)主要因素 [14]。 目前多數(shù)研究者主要用磷脂膜模型體系來(lái)研究 抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用, 也有些研究者利用膜 潛在的敏感染料和熒光標(biāo)記肽段來(lái)研究抗菌肽與細(xì) 胞的相互作用 [15]。關(guān)于抗菌肽的抗菌機(jī)制目前還沒(méi) 有在研究者中達(dá)到一致意見(jiàn), 根據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道, 可以大致將其分為 4 個(gè)階段(如圖 1 所示)：1) 抗菌 肽與細(xì)胞膜的初級(jí)接觸階段, 2) 抗菌肽閥濃度及構(gòu) 象變化階段, 3) 膜透化階段, 4) 細(xì)胞死亡階段。

2.1

抗菌肽與細(xì)胞膜初期接觸 關(guān)于抗菌肽與細(xì)胞膜的初期相互作用目前主要

存在兩種說(shuō)法, 分別是靜電相互作用及受體介導(dǎo)的 相互作用�？咕耐ㄟ^(guò)靜電作用與微生物細(xì)胞膜結(jié) 合早已被普遍認(rèn)可, 以革蘭氏陰性細(xì)菌為例, 1997 年 Hancock 提出抗菌肽與細(xì)胞膜最初結(jié)合時(shí), 與

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圖1
Fig. 1

抗菌肽抗菌機(jī)制圖

The antibacterial mechanism of antimicrobial peptides

LPS 結(jié)合的二價(jià)陽(yáng)離子被抗菌肽競(jìng)爭(zhēng)性代替, 且抗 菌肽與 LPS 的結(jié)合能力比陽(yáng)離子 Ca 和 Mg 的結(jié)合 能力高出 3 個(gè)數(shù)量級(jí)
[16] 2+ 2+

但越來(lái)越多的研究也表明, 少數(shù)抗菌肽是通過(guò)受體 介導(dǎo)與細(xì)胞膜相結(jié)合, 其中研究最多的是 Nisin。 Nisin 能夠與細(xì)胞壁合成的基本前體 Lipid Ⅱ特異性 結(jié)合, 促使革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌膜上形成孔洞從而對(duì)細(xì) 菌有很強(qiáng)的殺傷性。通過(guò)高分辨核磁共振分光檢定 法(High resolution NMR)研究 nisin 和 Lipid Ⅱ 在 SDS 膠束中的相互作用, 結(jié)果認(rèn)為 nisin 的 N 端首先 結(jié)合到 Lipid Ⅱ上, 發(fā)生結(jié)構(gòu)重排, 而 nisin 的 C 端 則激活孔洞形成 [18]。另外發(fā)現(xiàn)不是所用的天然的 L 型抗菌肽與其 D 型異構(gòu)體都具有一樣的活性 [19], 因 此受體介導(dǎo)的相互作用對(duì)某些抗菌肽與微生物表面


。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌缺乏細(xì)胞

外膜或者 LPS, 不過(guò)其細(xì)胞被膜上含有豐富的帶負(fù) 電 荷 的 磷 壁 酸 和 糖 醛 酸 磷 壁 酸 。 Staphylococcus aureus 含有一種未知的抗菌肽抗性機(jī)制, 對(duì)防御素 不 敏 感 , Peschel A 等 人 研 究 發(fā) 現(xiàn) 其 抗 性 與 基 因 mprF 密切相關(guān), mprF 控制 L-賴氨酸修飾磷脂酰甘 油的過(guò)程導(dǎo)致膜表面負(fù)電荷的降低, 而 mprF 缺失 的突變株對(duì)抗菌肽的敏感性增加 [17]。盡管關(guān)于抗菌 肽與細(xì)胞膜的靜電相互作用在研究者中已達(dá)到共識(shí),

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的結(jié)合及隨后的殺傷活性十分重要。

肽至少是有 22 個(gè)氨基酸的 α 螺旋結(jié)構(gòu)的肽, 或者是 有 8 個(gè)氨基酸的具有 β 折疊構(gòu)象的肽 [23]。這個(gè)模型 已經(jīng)提出超過(guò) 10 年了, 不過(guò)幾乎還沒(méi)有一個(gè)十分確 切的證據(jù)來(lái)證明此機(jī)制。 2) “環(huán)形孔”(蟲(chóng)孔)模型：“蟲(chóng)孔”模型首先 由 Hara T 等人在研究α螺旋肽 mafainins 和 PGLa 時(shí) 提出來(lái), 最近有很多研究支持該模型, 其與“桶板” 模型最主要的不同在于脂類與抗菌肽一起形成跨膜 通道。通過(guò) NMR、熒光淬滅及 CD 等方法證實(shí), 胞 外的抗菌肽在與帶電荷及疏水的細(xì)菌細(xì)胞膜相互作 用時(shí), 形成α螺旋構(gòu)象 [24]。 結(jié)合到細(xì)胞膜上的肽的疏 水殘基極性頭移位造成疏水域的裂口及引起細(xì)胞膜 正向彎曲拉伸。裂口與拉伸進(jìn)一步破壞了膜的完整 性, 當(dāng)抗菌肽與脂類的比率達(dá)到一定臨界值時(shí), 抗 菌肽開(kāi)始垂直定向于細(xì)胞膜, 單環(huán)開(kāi)始自我聚集, 形成動(dòng)態(tài)的肽-脂類超分子復(fù)合物 [25]。 該環(huán)形孔的形 成及易位決定于抗菌肽與脂類的比率, 抗菌肽濃度 太高時(shí)由于其正電荷側(cè)鏈靜電排斥作用導(dǎo)致孔穩(wěn)定 性降低。 有研究報(bào)道, 當(dāng)脂類與 mellitin 的比率達(dá)到 50 時(shí), 有直徑 2.5 nm~3.0 nm 的孔的形成, 另外當(dāng)該 比率增加時(shí), 孔的直徑隨之增加 [20,26]。Magainin 誘 導(dǎo)生成的“蟲(chóng)孔”直徑較 大, 內(nèi)徑 大約 為 3.0 nm~ 5.0 nm, 外徑則為 7.0 nm~8.4 nm, 每個(gè)孔僅有 4~7 個(gè) magainin 單體, 卻有約 90 個(gè)脂質(zhì)分子 [27,28]。 3)“氈毯”模型：陽(yáng)離子抗菌肽平行排列在細(xì) 胞壁表面形成類似“氈子”的結(jié)構(gòu), 與其他模型一樣, 陽(yáng)離子抗菌肽通過(guò)靜電作用結(jié)合到細(xì)胞膜上, 覆蓋 在磷脂雙層上, 當(dāng)抗菌肽密度達(dá)到一定臨界值時(shí), 細(xì)胞膜能量惡化, 完整性喪失, 細(xì)胞膜出現(xiàn)顯著的 彎曲從而破裂。此模型中陽(yáng)離子抗菌肽的疏水部分 并 不 插 入 細(xì) 胞 膜 , 細(xì) 胞 膜 也 并 無(wú) 槽 的 形 成 [29] 。 Cecropin P1 以 這 種 機(jī) 制 作 用 于 微 生 物 , 通 過(guò) 對(duì) cecropin P1 進(jìn)行極化 ATR-FTIR 光譜學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 該肽最初定向平行于膜表面, 隨著抗菌肽濃度的增 加在膜表面形成了肽單體的濃縮層, 最終導(dǎo)致細(xì)胞 膜的破裂 [14]。 4)“凝聚”模型：膜的透化作用對(duì)于抗菌肽的 抗菌活性是必要的但還不足以解釋其殺菌活性, 某 些抗菌肽如 Gramicidin S 在低于其 MIC 時(shí)就能引起 最大程度的膜去極化, 這說(shuō)明單單細(xì)胞膜去極化并 不是微生物死亡的最關(guān)鍵的因素。凝聚模型認(rèn)為抗 菌肽插入到細(xì)胞膜后, 由肽和脂質(zhì)組成膠束復(fù)合物,

2.2

抗菌肽與膜結(jié)合之后的主要變化
抗菌肽與細(xì)胞膜表面結(jié)合之后, 進(jìn)入第 2 個(gè)作

用階段, 可稱之為閾濃度階段。這個(gè)階段首先包括 了抗菌肽在細(xì)胞膜表面的積累, 影響閾濃度的參數(shù) 很多, 如抗菌肽濃度、自我聚集的傾向和磷脂膜的 組成成分、流動(dòng)性、首基的大小等
[20]

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濃度的另外一個(gè)重要因素是許多細(xì)菌細(xì)胞膜的膜電 位(?ψ), 人們推測(cè)?ψ牽動(dòng)著陽(yáng)離子肽泳向非極性細(xì) 胞膜環(huán)境, 并有效地降低了孔洞形成的能量障礙。 一些抗菌肽的活性依賴于相當(dāng)量的?ψ如 nisin, 當(dāng)其 N 端的賴氨酸被亮氨酸取代之后, nisin 喪失其電壓 依賴性
[21]

。

抗菌肽與細(xì)胞膜結(jié)合之后發(fā)生結(jié)構(gòu)或構(gòu)象的轉(zhuǎn) 變, α螺旋肽很好地證明了這個(gè)說(shuō)法。研究證明, α螺 旋抗菌肽在水溶液環(huán)境中呈無(wú)規(guī)則構(gòu)象, 然而與磷 脂雙層相結(jié)合后則迅速形成嚴(yán)格的兩親性α螺旋構(gòu) 象。有趣的是, 一些抗菌肽只有與負(fù)電荷雙分子層 結(jié)合時(shí)才能完成構(gòu)象的轉(zhuǎn)變, 如蛙皮肽 PGLa 與由 磷酸卵磷酯和鞘磷脂組成的膜結(jié)合時(shí), 顯示無(wú)規(guī)則 構(gòu)象, 只有與由磷脂酰甘油和腦磷酯組成的膜作用 時(shí), 形成α螺旋構(gòu)象 [22]。 另有研究認(rèn)為抗菌肽與細(xì)胞 膜結(jié)合之后, 抗菌肽之間或抗菌肽與脂質(zhì)會(huì)相互作 用, 可能會(huì)形成絡(luò)合物結(jié)構(gòu), 不過(guò)抗菌肽形成四 級(jí)結(jié)構(gòu)的潛力與其自身單體的組成及構(gòu)象有根本關(guān) 系 [14]。 2.3 膜透化機(jī)制 關(guān)于膜透化作用已經(jīng)提出了許多機(jī)制, 由于微 生物超微結(jié)構(gòu)的差異性, 同種抗菌肽可能通過(guò)不同 的抗菌機(jī)制作用于不同微生物�？咕囊部赡苡貌� 同的機(jī)制殺死同一個(gè)物種, 這決定于一些因素如生 長(zhǎng)狀態(tài)、組織位置、其他免疫機(jī)制的存在或缺乏等 等。以下討論的 4 種機(jī)制是目前根據(jù)大量的研究得 出的理論, 要指出的是, 在這個(gè)領(lǐng)域的研究者們目 前還沒(méi)有達(dá)到完全的意見(jiàn)一致。 1) “桶板”模型：數(shù)量相對(duì)較少的陽(yáng)離子抗菌 肽在電荷的作用下, 結(jié)合在細(xì)胞膜表面并相互聚合, 肽分子中的疏水面向外朝向細(xì)胞膜的�；�, 而親 水面形成孔或槽, 形成橫跨細(xì)胞膜的離子通道。離 子通道一旦形成, 外界的水分即可滲入細(xì)胞內(nèi)部, 細(xì)胞質(zhì)也可滲透到外部。由于失去能量, 嚴(yán)重時(shí)細(xì) 胞膜即會(huì)崩解而導(dǎo)致細(xì)胞死亡 [21]。形成跨膜的抗菌


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以凝聚物形式橫跨細(xì)胞膜, 形成動(dòng)態(tài)的孔, 抗菌肽 透過(guò)這種機(jī)制也可以進(jìn)入胞內(nèi)。與蟲(chóng)孔模型不同, 在此模型中抗菌肽沒(méi)有特定的取向
[30]

抗菌肽在殺滅一些敏感病菌時(shí)效果不如特定的傳統(tǒng) 抗生素好, 但其優(yōu)勢(shì)之一就是能有效的作用于多重 耐藥性菌, 其殺菌作用十分迅速且具有復(fù)雜的細(xì)菌 胞內(nèi)作用靶點(diǎn)。 與傳統(tǒng)抗生素相比, 抗菌肽具有許多臨床應(yīng)用 的優(yōu)點(diǎn) [1]：1) 抗菌肽除了能殺滅細(xì)菌、真菌、寄生 蟲(chóng)和病毒之外, 也對(duì)癌細(xì)胞有一定殺傷作用, 此外 抗菌肽在先天及獲得性免疫方面扮演著十分重要的 角色; 2) 傳統(tǒng)抗生素對(duì)細(xì)菌的作用靶點(diǎn)通常是單一 的個(gè)體或者族群(如青霉素結(jié)合蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶 等), 而抗菌肽的作用靶點(diǎn)并不如此特定, 可能存在 多靶點(diǎn); 3) 在耐藥性上, 傳統(tǒng)抗生素的抗藥性菌產(chǎn) 生頻率大約為 10?7 至 10?10, 或者僅僅在亞 MIC 濃 度下幾代產(chǎn)生, 而對(duì)于抗菌肽來(lái)說(shuō), 耐藥性一般不 能直接產(chǎn)生, 需要在亞 MIC 下誘導(dǎo)許多代后才有耐 藥性菌的產(chǎn)生; 4) 抗菌肽由于蛋白酶的水解作用, 其半衰期較傳統(tǒng)抗生素要短許多; 5) 抗菌肽可以相 對(duì)獨(dú)立的發(fā)揮其抗菌作用, 也可以與其他因子協(xié)同 作用, 顯示出更高的活性, 抗菌肽之間, 抗菌肽與 傳統(tǒng)抗生素具有協(xié)同作用, 也與乳鐵蛋白、溶菌酶 等發(fā)生作用以提高活性 [35]。

。

2.4

細(xì)胞死亡
僅僅是膜通透性的改變不能完全解釋抗菌肽的

強(qiáng)殺菌作用, 細(xì)胞膜透化作用和細(xì)胞死亡不存在必 然的聯(lián)系, 某些抗菌肽在最低有效濃度時(shí)不會(huì)引起 細(xì)胞膜的透化但是仍然可以殺死細(xì)菌。在細(xì)胞死亡 的過(guò)程中, 細(xì)胞膜的透化作用與細(xì)胞內(nèi)功能的破壞 相比, 對(duì)細(xì)胞死亡的影響相對(duì)較小。許多抗菌肽穿 過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)積累并干擾胞內(nèi)正常功能, 引起 細(xì)菌死亡, 因此研究者們認(rèn)為抗菌肽存在著胞內(nèi)作 用靶點(diǎn)。胞內(nèi)殺菌機(jī)制主要有以下幾種 [31]：1) 引起 胞內(nèi)物質(zhì)的絮凝反應(yīng), 2) 抑制細(xì)胞壁生成, 3) 與核 酸物質(zhì)相結(jié)合, 4) 抑制核酸或蛋白質(zhì)合成, 5) 抑制 酶的活性, 6) 改變細(xì)胞膜：抑制隔膜形成。魚(yú)類抗 菌肽 pleurocidin 的衍生物, 在其有效抑菌濃度時(shí)可 以抑制 DNA、RNA 的合成而不引起細(xì)胞膜的透 化 [32]。兩個(gè)來(lái)源于牛中的抗菌肽 Bac5 和 Bac7, 抑 制 E. coli 和 Klebsiella pneumoniae 中 蛋 白 質(zhì) 和 RNA 的生成, 并引起 ATP 的下降阻止呼吸作用 [33]。 富組蛋白 Histatins 與真菌細(xì)胞膜上的一個(gè)受體相結(jié)合 后, 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)正在進(jìn)行積極呼吸的細(xì)胞 ATP 的 大量損失, 從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡, 此外還發(fā)現(xiàn) Histatins 可以破壞細(xì)胞周期并導(dǎo)致活性氧簇的產(chǎn)生 [34]。 綜上所述, 抗菌肽的作用機(jī)制根據(jù)其作用細(xì)胞 的特異性、抗菌肽自身的濃度、微生物細(xì)胞膜的生 物物理性質(zhì)等不同。與此同時(shí), 在殺滅同一種微生 物時(shí), 抗菌肽可能會(huì)運(yùn)用超過(guò)一種機(jī)制, 如細(xì)胞膜 透化機(jī)制與抑制胞內(nèi)一種或幾種重要物質(zhì)的正常功 能相結(jié)合來(lái)殺死微生物。另外需要注意的是, 在研 究中所使用的模擬膜系統(tǒng)、運(yùn)用的方法、抗菌肽所 處狀態(tài)的不同, 很可能得出的抗菌機(jī)制不同。目前 許多研究者用多種方法、從不同角度來(lái)研究抗菌肽 作用機(jī)理, 以期得到更為可靠的結(jié)果。

3.2

抗菌肽臨床應(yīng)用現(xiàn)狀
抗菌肽類藥物已經(jīng)開(kāi)始走入醫(yī)藥市場(chǎng), 已知的

有兩種局部性和兩種全身性應(yīng)用于臨床的抗菌肽類 藥物, 局部應(yīng)用的藥物包括 polymyxins 和 gramicidin S, 用來(lái)治療由 P. aeruginosa 和 Acinetobacter baumannii 引起的感染, 臨床證實(shí)其安全及有效, 也 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗藥性。 不幸的是 Polymyxins 和 gramicidin S 都具有很大的毒性, 這阻礙了其作為全身用藥的 使用。臨床上一般將 polymyxins 和 gramicidin S 一 起用于燒傷后皮膚再生、手術(shù)傷口灌洗、消化道選 擇性去污染、眼部的表面感染及小傷口感染等。后 續(xù)很多研究努力降低其毒性, 效果甚微, 卻發(fā)現(xiàn)了 colistin (polymyxin E1、 E3)的前體 colomycin, 能 E2、 全身性的用于患有纖維囊泡癥的病人的肺部感染[36]。 Daptomycin 是 1 種陰離子脂肽, 針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌 有殺菌作用, 2003 年 9 月, FDA 批準(zhǔn)其用于并發(fā)性的 皮膚感染, 有趣的是其功能依賴于 Ca2+, 在 Ca2+的 存在下 daptomycin 與細(xì)菌細(xì)胞膜的相互作用與陽(yáng)離 子抗菌肽類似 [37]。 Pexiganan 是 magainin2 的 1 種同系物, 具有 22 個(gè)氨基酸, 是第 1 個(gè)應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥 LocilexTM


3
3.1

抗菌肽臨床應(yīng)用
抗菌肽臨床應(yīng)用優(yōu)點(diǎn) 抗菌肽具有新的抗生素類所需要的很多特性,

它可以作為單獨(dú)的抗菌劑使用, 也可以與傳統(tǒng)的抗 生素聯(lián)合使用具有協(xié)同作用, 作為免疫調(diào)制劑或中 和內(nèi)毒素, 因此抗菌肽的臨床應(yīng)用潛力很大。盡管

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微生物學(xué)通報(bào)

2009, Vol.36, No.1

局部治療的抗生素乳膏。1999 年 FDA 因?yàn)槠湫в?與現(xiàn)有的抗生素相比并不顯著否決了這項(xiàng)新藥, 盡 管在進(jìn)行 II 期臨床試驗(yàn)時(shí), pexiganan 具有良好的療 效
[38]

于插管相關(guān)的感染, 在已完成的 III 期臨床試驗(yàn)中, MX-226 降低了 49%的局部導(dǎo)管感染率和 21%的導(dǎo) 管微生物定植, 2005 年 Migenix 和 Cadence Pharmaceuticals 合作啟動(dòng)了證實(shí)其抑制局部導(dǎo)管感染效力 的 IIIb 期臨床試驗(yàn)。MX-594AN 是 1 種新的用于治 療座瘡的藥物, 2003 年Ⅱb 臨床試驗(yàn)完成( migenix.com)。除以上介紹的藥物外, 還有一些抗 菌肽類藥品進(jìn)入臨床或臨床前試驗(yàn)狀態(tài), 如表 1 所 示 [1,40?42]。

。Iseganan 是豬的內(nèi)源性抗微生物多肽

protegrin-1 的類似物, Trotti A 等報(bào)道 Iseganan 在Ⅲ 期臨床試驗(yàn)中沒(méi)有能夠避免或減輕患有頭與頸部惡 性腫瘤的病人在接受放射療法時(shí)的口腔黏膜炎及呼 吸器相關(guān)性肺炎
[39]

。 目前應(yīng)用前景很好的有 MX-226

和 MX-594AN 兩種抗菌肽類藥物。MX-226 主要用
表1
產(chǎn)品 Product Polymixin B-Collstin-Colomycin Daptomycin Cyanovirin-N Pexiganan Iseganan(IB-367, protegrin) Enfuvirtide, T-20 MX-226(CPI-226) PG-1 protegrin MX-594AN Neuprex P113/P113D Hlf1-11 D2A2 SB006 Plectasin IMXC001 lactoferricin-B HB 50 公司 Company RX Generic Drugs Cubist Pharmaceuticals Biosyn Genaera plymouthMeeting Intrabiotics Trimeris Cadencepharm Intrabiotics Migenix Xoma Corp Demegen/Pacgen AM-Pharma Demegen SpiderBiotech Novozymo Inimex Pharmaceuticals AM Helix Biomedix

抗菌肽類藥物開(kāi)發(fā)情況
治療疾病 Applications 用于 G-引起的皮膚感染 用于 G+引起的皮膚感染, 膿毒癥 HIV 病毒 應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥 LocilexTM 局部治療 粘膜炎、膽囊纖維化、肺部感染 艾滋病 中心靜脈導(dǎo)管感染 金黃色釀膿葡萄球菌等引起的腹膜感染 痤瘡 腦膜炎 口腔粘膜炎 同種干細(xì)胞移植術(shù)中細(xì)菌和真菌感染 燒傷、感染 G-引起的感染 G-引起的感染 膿毒癥 真菌感染 金黃色釀膿葡萄球菌引起的傷口感染 開(kāi)發(fā)階段 Phase of clinical trials 已上市 2003 年 9 月 FDA 批準(zhǔn)上市 新藥審查中 FDA 否決 Ⅲ期失敗 Ⅲ期 Ⅲb 期 Ⅲ期 2003 年Ⅱb 完成 Ⅲ期失敗 Ⅱb 期 Ⅱ期 Ⅱ期 臨床前試驗(yàn) 臨床前試驗(yàn) 臨床前試驗(yàn) 臨床前試驗(yàn) 臨床前試驗(yàn)

Table 1 Clinical development of antimicrobial peptides

抗菌肽所具有的生物活性特點(diǎn)使之具有更廣泛 的用途, 如被用來(lái)研究成為化學(xué)避孕套以防止性傳 播疾病的傳播, 也用來(lái)作為探針檢測(cè)細(xì)菌或者真菌 類感染。在惡性腫瘤的治療中, 多向性抗藥(MDR) 是許多癌癥化學(xué)治療失敗的原因之一, 通常由于 P糖蛋白的過(guò)度表達(dá)所引起, 研究證實(shí)一些抗菌肽通 過(guò)觸發(fā)編程性細(xì)胞死亡或形成離子通道對(duì)癌細(xì)胞具 有細(xì)胞毒性且副作用與現(xiàn)有的傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物相 比要小很多, 其中的一些抗菌肽還可以作用于 MDR 癌細(xì)胞 [43]。抗菌肽除了能夠直接發(fā)揮其抗菌作用外,


還可以作為藥物載體。施藥載體所必須具備的 2 個(gè) 條件是：1) 無(wú)毒性或低毒性; 2) 具有滲透細(xì)胞的能 力。Laszlo Otvos 將昆蟲(chóng)抗菌肽 pyrrochoricin 和其衍 生物作為施藥運(yùn)載工具, 證實(shí) pyrrochoricin 同系物具 有運(yùn)載抗原依賴性疫苗的潛力 [44]。Magainin 與溶于 50%乙醇的表面活性劑增強(qiáng)劑 N-月桂酰肌氨酸一起可 以破壞皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)結(jié)構(gòu), 從而增加了 47 倍的 皮膚透過(guò)性, 這一結(jié)果對(duì)穿皮給藥法意義重大[45]。 3.3 抗菌肽應(yīng)用所面臨的問(wèn)題及解決方案 高生產(chǎn)成本是阻礙抗菌肽大規(guī)模臨床應(yīng)用的最

侯曉姝等: 抗菌肽的抗菌機(jī)制及其臨床應(yīng)用

103

首要的問(wèn)題, 現(xiàn)有的抗菌肽價(jià)格大約為 50-400 美元 每克, 這對(duì)于大多數(shù)人都難以負(fù)擔(dān), 因此急需建立 商業(yè)化生產(chǎn)平臺(tái)。很多研究者在致力于解決生產(chǎn)成 本的問(wèn)題, T-20 是一種 HIV 結(jié)合抑制肽, 由 Roche 公司第一次采用固相-液相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)其噸級(jí) 生產(chǎn)。合成法生產(chǎn)抗菌肽時(shí), 減少肽的大小十分重 要, 很多藥業(yè)公司開(kāi)始尋找更小的抗菌肽。運(yùn)用基 因工程手段, 在微生物中進(jìn)行重組表達(dá)是減少成本 的 另 一 個(gè) 選 擇 。 Novozyme 公 司 ()報(bào)道其利用真菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了符 合臨床給藥要求的高產(chǎn)量及高活性 Plectasin, 該表 達(dá)系統(tǒng)也已被用來(lái)生產(chǎn)其他的蛋白質(zhì)。Plectasin 是 第一個(gè)具有臨床應(yīng)用潛力的真菌防御素, 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 證實(shí)了其在治療細(xì)菌性腹膜炎和肺炎的有效性 [46]。 盡管很多抗菌肽在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出了抗菌活 性, 但在生理鹽及血清條件下, 其抗菌活性幾乎消 失。人 β 防御素在高鹽濃度的囊性纖維化支氣管肺 液中喪失了其抗 P. aeruginosa 能力, 從而導(dǎo)致致命 的慢性感染
[47]

因素, 如可能存在的毒性問(wèn)題、對(duì)抗菌肽的藥效學(xué) 及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的不足等, 不過(guò)研究者們都 在致力于解決這些問(wèn)題。人們開(kāi)始尋找更多的適合 大量生產(chǎn)抗菌肽的體系, 酵母菌、大腸桿菌、植物 等等表達(dá)體系都被用來(lái)研究其生產(chǎn)能力及活性。而 對(duì)天然抗菌肽的結(jié)構(gòu)改造, 除了讓其分子更小、活 性更高外, 也減少了對(duì)真核生物的毒性及縮小生產(chǎn) 成本。受到矚目的耐藥性問(wèn)題雖然有研究證實(shí)其產(chǎn) 生的可能性, 但都是在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件下, 經(jīng)過(guò)很 多代的篩選而出現(xiàn), 實(shí)際應(yīng)用時(shí)相對(duì)來(lái)講耐藥菌的 產(chǎn)生還是很困難的�？傊�, 在傳統(tǒng)抗生素耐藥性問(wèn)題 十分嚴(yán)峻的情況下, 抗菌肽的臨床應(yīng)用潛力很大。

4

結(jié)束語(yǔ)
抗菌作為天然免疫分子是許多生物抵御病菌感

染的“化學(xué)屏障”, 其有效抵御病毒的歷史十分久遠(yuǎn), 可能隨著生物的進(jìn)化而進(jìn)化, 而一些研究也表明在 生物體內(nèi)存在著抗菌肽的信號(hào)通路。因此, 可以認(rèn) 為抗菌肽是生物體的一個(gè)部分, 其在生物體內(nèi)所具 有的作用可能還有一些有待發(fā)現(xiàn)。另外其抗菌機(jī)制 不同于傳統(tǒng)抗生素, 產(chǎn)生耐藥性菌株的可能性大大 降低, 因此有很大的潛力成為傳統(tǒng)抗生素的替代品 或輔助治療品。 抗菌肽應(yīng)用于臨床方面有 2 個(gè)途徑： 1) 直接作為臨床應(yīng)用藥物, 殺死病原體; 2) 利用外 界刺激或者分子調(diào)控等方法調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗菌肽的表 達(dá)。前者已經(jīng)有了許多進(jìn)展, 盡管到現(xiàn)在為止真正 應(yīng)用到治療中的抗菌肽類藥物很少, 也存在著一些 問(wèn)題尚未解決, 很多這方面的研究工作正在進(jìn)行, 一些大的制藥公司也關(guān)注于幾種抗菌肽并進(jìn)行其臨 床前及臨床研究。對(duì)于第 2 種途徑, 可能是解決很 多現(xiàn)代醫(yī)療難題的更好、更徹底的選擇, 其面臨的 挑戰(zhàn)也更大。目前關(guān)于抗菌肽的研究十分多, 包括 從分子水平上研究抗菌肽基因的調(diào)控途徑, 分析抗 菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系, 人為改造或合成抗菌肽, 找到合適的生產(chǎn)體系以期得到商業(yè)化生產(chǎn), 抗菌肽 藥物的臨床研究等等。我們相信隨著研究的深入, 問(wèn)題將一個(gè)個(gè)被攻破, 抗菌肽將會(huì)越來(lái)越多的造福 于人類。

。然而有些肽如 polyphemusins 其活

性對(duì)鹽濃度不是十分敏感, 可以通過(guò)改變抗菌肽的 親水疏水性、電荷及 α 螺旋度來(lái)降低多肽對(duì)鹽的敏 感性 [48]。 抗菌肽抵御細(xì)菌等的感染已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史, 其抗菌機(jī)制決定了敏感性細(xì)菌要產(chǎn)生抗藥性的話, 其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)必須有很大的改變, 而這種結(jié)構(gòu)改變 極可能對(duì)細(xì)菌本身有著更大的生命威脅, 因此敏感 細(xì)菌的耐藥性似乎不太可能。而抗菌肽的多樣性、 感染方式的不同及抗菌肽作用機(jī)制的差異也預(yù)示著 天然的細(xì)菌群體產(chǎn)生抗藥性的產(chǎn)生十分困難。不過(guò) 總存在著一定的病菌, 由于有著十分穩(wěn)定的細(xì)胞膜 結(jié)構(gòu)或功能性特點(diǎn)使之具有天生的耐藥性。另 外 Perron GG 等報(bào)道, 在實(shí)驗(yàn)室中對(duì) Escherichia coli 和 Pseudomonas fluorescens 進(jìn)行持續(xù)不斷的篩選, 經(jīng)過(guò)了 600~700 代后, 22/24 的譜系獨(dú)立進(jìn)化出了可 遺傳的對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽 pexiganan 的耐藥性 [49]。這 一研究結(jié)果顯示, 抗菌肽在臨床應(yīng)用時(shí), 也有可能 導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生, 雖然其可能性比傳統(tǒng)抗生素 小的多, 但也不得不提醒我們?cè)谟每咕倪M(jìn)行治療 時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控以避免耐藥性的出現(xiàn)。 目前抗菌肽用于臨床治療還存在著其他的制約

參 考 文 獻(xiàn)
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