本文關(guān)鍵詞：模擬失重條件下骨相關(guān)細胞因子對前成骨細胞的調(diào)控作用研究

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【摘要】：中長期空間飛行導致機體發(fā)生的骨丟失等航天醫(yī)學問題,已經(jīng)成為人類向更深、更遠、更高的外層空間探索的制約因素之一。目前空間飛行采取的運動鍛煉、藥物預防和營養(yǎng)補充都不能有效防止骨丟失的發(fā)生發(fā)展;為了確保航天員在未來長期飛行任務中健康、高效工作,需要在細胞分子水平闡明空間骨丟失的發(fā)生機制;發(fā)展基于細胞分子本質(zhì)認識的有效對抗防護措施。這是載人航天發(fā)展的迫切和必然要求。 空間骨丟失是航天員在太空易患疾病的首要風險因素,其發(fā)生的主要原因是骨形成減少。失重不但影響成骨細胞的分化進程,還影響其分化起始。啟動和調(diào)控成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1,也是一個力信號傳導的靶分子。骨相關(guān)細胞因子參與了成骨細胞的增殖、分化調(diào)節(jié),包括對Cbfa1活性的調(diào)節(jié)。失重影響多個骨相關(guān)細胞因子的表達和信號傳導。因此,闡明失重條件下骨相關(guān)細胞因子在骨丟失中的作用,對骨丟失機制的闡明和發(fā)展有效對抗防護措施具有重要意義。 前期研究表明失重條件下,骨相關(guān)細胞因子對BMSC和前成骨細胞的增殖、分化的促進作用減弱,使成骨細胞數(shù)量減少和活性下降,導致骨形成減弱,進而發(fā)生骨質(zhì)丟失。因此,本研究構(gòu)建了能用報告基因反映Cbfa1活性的成骨細胞模型和IGF-I選擇性剪接模型;采用細胞回轉(zhuǎn)、大鼠尾吊和液流剪切等力刺激模型;研究骨相關(guān)細胞因子對BMSC增殖、對前成骨細胞Cbfa1活性的影響及可能的機制,觀察尾吊大鼠骨骼組織中IGF-I基因表達和調(diào)控變化;旨在探討骨相關(guān)細胞因子在失重條件下表達、調(diào)控和作用的變化,為闡明空間骨丟失的細胞分子機制提供科學依據(jù)。 實驗方法:(1)采用基于紅細胞裂解的全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSC,通過亞甲基藍染色和流式細胞儀檢測,觀察回轉(zhuǎn)對BMSC增殖、細胞周期及對細胞因子促增值效應的影響;采用免疫熒光染色、RT-PCR、Western、基因芯片方法,研究回轉(zhuǎn)對BMSC微絲骨架、ERK1/2活性、成骨向分化、基因表達譜的影響。(2)通過載體構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,構(gòu)建用報告基因反映成骨細胞Cbfa1活性的模型,通過EGFP的熒光強度半定量分析或Luc酶活性分析,研究不同重力、VD3和BMP2對Cbfa1活性的影響以及回轉(zhuǎn)條件下Cbfa1對VD3和BMP2的響應特征;通過雙向CO-IP,觀察回轉(zhuǎn)和超重條件下VDR與Cbfa1相互作用的變化;采用微絲骨架破壞劑CB和穩(wěn)定劑JAS,研究細胞微絲骨架在BMP2誘導Cbfa1活性中的作用。(3)利用細胞回轉(zhuǎn)和大鼠尾吊模型,采用RT-qPCR方法,研究回轉(zhuǎn)和不同尾吊時間對成骨細胞、骨骼組織IGF-I選擇性剪接異構(gòu)體表達的影響;通過PCR擴增和基因亞克隆,構(gòu)建了4個含IGF-I外顯子5及兩側(cè)不同長度內(nèi)含子的選擇性剪接載體,分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1中,建立IGF-I選擇性剪接模型;利用流體剪切實驗系統(tǒng);觀察1Pa剪切力刺激1小時對IGF-I選擇性剪接的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)回轉(zhuǎn)破壞細胞微絲骨架,并具有時間依賴性;使G1/G0期的細胞數(shù)量增加,由86.6%增加到91.4%,從而抑制了BMSC增殖;降低了信號分子ERK1/2活性和細胞因子IGF-I、EGF和bFGF對BMSC的促增殖作用,促增殖效應分別由15.5%、16.3%和26.9%下降到10.5%、10.3%和19.6%;抑制了BMSC的成骨向分化潛能;基因表達譜和功能聚類分析表明與細胞周期、微絲骨架、成骨細胞分化相關(guān)基因的表達發(fā)生了改變,且表達升高的負調(diào)控基因占多數(shù)。(2)建立了能用EGFP或Luc報告基因反映Cbfa1活性的成骨細胞模型;發(fā)現(xiàn)回轉(zhuǎn)抑制Cbfa1活性,而超重能提高Cbfa1活性;VD3和BMP2均可提高Cbfa1的活性,但回轉(zhuǎn)可降低VD3和BMP2對Cbfa1活性的刺激作用,回轉(zhuǎn)條件下VD3和BMP2誘導的Cbfa1活性增加分別由79%和18%下降到43%和14%,同時VD3受體VDR與Cbfa1之間的相互作用受到抑制;回轉(zhuǎn)可破壞MG63的微絲骨架;低濃度微絲骨架破壞劑CB(0.5nmol/L)降低了BMP2對Cbfa1活性的增強作用,而微絲骨架穩(wěn)定劑JAS在一定程度上能保護BMP2對Cbfa1活性的刺激作用。(3)大鼠尾吊降低骨骼組織IGF-IEa和MGF的表達,且具有時間依賴性;使血清中IGF-I水平下降。篩選出了4個分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含外顯子5及兩側(cè)不同長度內(nèi)含子的IGF-I選擇性剪接載體的細胞株;1Pa流體力能顯著提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p5341選擇性剪接載體細胞株的MGF-EGFP表達,而對其他細胞株沒有影響。 結(jié)論:回轉(zhuǎn)抑制了BMSC的增殖和骨向分化潛能,降低其對細胞因子IGF-I、EGF和bFGF的響應性�；剞D(zhuǎn)通過削弱VDR與Cbfa1之間的相互作用,降低了VD3對Cbfa1活性的刺激作用;細胞微絲骨架參與BMP2對Cbfa1活性的刺激作用,而回轉(zhuǎn)誘導的微絲骨架解聚可能是Cbfa1對BMP2的響應性下降的重要原因;大鼠尾吊導致骨骼組織IGF-IEa和MGF表達下降和血清IGF-I水平降低;失重可以影響IGF-I選擇性剪接。剪切力可通過IGF-I內(nèi)含子上的元件調(diào)控其選擇性剪接。這些研究為闡明空間骨丟失的細胞分子機制提供重要的科學依據(jù)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R85

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1187208