本文關(guān)鍵詞：模擬失重條件下microRNA-494抑制成骨細(xì)胞分化作用機制的研究

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【摘要】：空間長期重力環(huán)境的改變會引起機體多個系統(tǒng)的變化,包括骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、免疫系統(tǒng)功能不全、心血管系統(tǒng)適應(yīng)性減弱等。通過物理訓(xùn)練和營養(yǎng)補充等措施的實施可以緩解肌肉萎縮、提高心血管系統(tǒng)的適應(yīng)性,然而,目前尚沒有辦法對抗微重力引起的宇航員骨質(zhì)流失,這是威脅長期進行太空工作宇航員身體健康的最主要因素之一。微重力導(dǎo)致骨質(zhì)流失速度大約為每月減少2 %的骨礦物質(zhì)密度,相當(dāng)于絕經(jīng)后婦女一年流失的骨量。研究表明,重力和機械負(fù)荷是保持骨骼完整性的重要因素,然而微重力環(huán)境引起骨質(zhì)丟失的機制尚不完全清楚。已有的研究顯示,失重引起的骨量減少是因為骨形成與重吸收之間的平衡被破壞,骨質(zhì)形成減少,而重吸收保持正�；蛟黾�,最終導(dǎo)致了骨量丟失。由于成骨細(xì)胞分化是骨骼形成和維持骨量的關(guān)鍵步驟,所以目前被普遍接受的觀點認(rèn)為微重力導(dǎo)致的骨丟失的主要原因是成骨的細(xì)胞分化障礙,但是導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化障礙的分子機制并不完全清楚。 miRNA是一類長度約18-25nt的小分子RNA,存在于包括哺乳動物在內(nèi)的多種有機生命內(nèi)。miRNA通過完全或不完全互補的方式結(jié)合于靶基因的mRNA的3’UTR,負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。大約超過30 %的基因表達(dá)都受到miRNA的調(diào)控,表明miRNA調(diào)控基因表達(dá)這一現(xiàn)象是普遍存在的。miRNA在細(xì)胞增殖、分化、死亡等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。許多研究認(rèn)為,miRNA參與了對成骨細(xì)胞成骨過程的表達(dá)調(diào)控,是成骨細(xì)胞分化的重要的調(diào)節(jié)分子。 本研究中我們以BMP-2誘導(dǎo)小鼠間充質(zhì)多能前體細(xì)胞C2C12成骨分化為研究對象,探討模擬失重狀態(tài)下,成骨細(xì)胞分化過程中miRNA表達(dá)譜的改變,進而研究miRNA在失重性骨丟失中的作用及其分子機制。本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)果如下: 1.微重力抑制成骨細(xì)胞分化和成熟。我們首先在細(xì)胞水平上檢測微重力對成骨細(xì)胞分化的影響。我們將C2C12細(xì)胞置于回轉(zhuǎn)器培養(yǎng),同時加入300 ng/ml BMP-2誘導(dǎo)分化,對照組不加BMP-2刺激。72小時后,Real-time PCR檢測成骨細(xì)胞特異基因堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP),骨鈣素(osteocalcin,OC),骨保護素(osteoprotegerin,OPG)和Runx2,結(jié)果顯示,在模擬失重環(huán)境下,成骨細(xì)胞分化受到顯著抑制。成骨細(xì)胞分化過程有多條通路參與,我們檢測了微重力對部分通路相關(guān)分子表達(dá)的影響。我們按上述方法處理C2C12細(xì)胞,72小時后收集細(xì)胞裂解液,Western blot結(jié)果顯示,微重力引起B(yǎng)MPR2、FGFR2、Runx2的蛋白表達(dá)降低。尾部懸吊能夠消除大鼠后肢機械負(fù)荷,是研究模擬失重的良好動物模型。本研究中我們采用核素骨掃描檢測了懸吊大鼠骨質(zhì)形成。我們發(fā)現(xiàn),與對照組大鼠相比懸吊大鼠骨和關(guān)節(jié)中99mTc-MDP的聚集明顯減少,而且差異隨懸吊時間延長而增大。該結(jié)果說明,微重力引起骨代謝減弱,骨生成減少。 2.微重力環(huán)境可以引起成骨細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的改變。我們將C2C12細(xì)胞置于回轉(zhuǎn)器中模擬失重培養(yǎng),模擬失重培養(yǎng)細(xì)胞與對照細(xì)胞均加入BMP-2誘導(dǎo)其向成骨方向分化。72小時后,收集細(xì)胞提取總RNA并進行miRNA芯片檢測。miRNA芯片篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)了7個顯著差異表達(dá)的miRNA,其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有2個,表達(dá)下調(diào)的miRNA有5個。Real-time PCR驗證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致,其中mmu-miR-494模擬失重后表達(dá)水平明顯升高,mmu-miR-18*, mmu-miR-122a, mmu-miR-301, and mmu-miR-340表達(dá)水平則顯著降低,但mmu-miR-143的表達(dá)與對照組相比無顯著差別。生物信息學(xué)方法預(yù)測表達(dá)上調(diào)的miR-494的靶基因參與成骨細(xì)胞分化,因此我們將關(guān)注的焦點放在對miR-494的研究上。給予BMP-2處理的C2C12細(xì)胞在模擬失重0、2、4、8、12、24、48和72小時后分別收集細(xì)胞檢測miR-494表達(dá)水平的變化。我們發(fā)現(xiàn),在模擬失重2小時,miR-494表達(dá)開始上升,并且隨著失重時間的延長,miR-494表達(dá)持續(xù)升高。此外,我們分離了懸吊大鼠股骨近側(cè)干垢端成骨細(xì)胞,檢測其中miR-494表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)懸吊2周和4周的大鼠其成骨細(xì)胞內(nèi)miR-494表達(dá)均明顯上調(diào),并隨懸吊時間的延長而持續(xù)升高。該實驗表明微重力環(huán)境能引起成骨細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的改變,其中mmu-miR-494的升高十分顯著,且其表達(dá)水平與模擬失重的時間正相關(guān)。 3. miR-494抑制成骨細(xì)胞分化。為了驗證miR-494對骨形成的作用,我們首先檢測miR-494對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。我們將miR-494 mimics及其相應(yīng)陰性對照(N.C.)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞,MTT實驗和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,miR-494對細(xì)胞增殖和周期無明顯影響。進一步的研究顯示,在BMP-2存在時,miR-494能明顯抑細(xì)胞ALP活性,但未給予BMP-2刺激時,這種抑制效果不顯著,表明miR-494可能參與了對C2C12細(xì)胞成骨分化的抑制。隨后,我們用Reai-time PCR、ELISA和Western Blot分別在mRNA水平和蛋白水平檢測了miR-494對成骨細(xì)胞特異基因ALP、OC、OPG、Runx2表達(dá)的影響。與ALP染色和活性測定結(jié)果一致,轉(zhuǎn)染miR-494后細(xì)胞中ALP mRNA表達(dá)降低,而且無論是否存在BMP-2,OC、OPG和Runx2表達(dá)也有所下降。ELIAS分析結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-494減少了細(xì)胞分泌OC和OPG。在BMP-2誘導(dǎo)下,Runx2蛋白表達(dá)上調(diào),但是轉(zhuǎn)染miR-494后Runx2的上調(diào)被抑制。Osx是Runx2下游基因,我們發(fā)現(xiàn)在BMP-2誘導(dǎo)分化的C2C12細(xì)胞中過表達(dá)miR-494抑制了Osx的表達(dá)。另外,我們還發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中過表達(dá)miR-494后,其成肌分化的相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了上調(diào),而miR-494對C2C12細(xì)胞成脂分化無明顯作用。我們的研究表明,miR-494能抑制細(xì)胞的成骨分化。 4. miR-494通過調(diào)節(jié)Runx2、BMPR2和FGFR2的表達(dá)抑制成骨細(xì)胞分化。我們用生物信息學(xué)方法在包括miRanda、TargetScan、pictar和RNAhybrid databases等在內(nèi)的多個網(wǎng)站進行miR-494靶基因預(yù)測,得到可能的靶基因超過1,000個。我們進一步從中篩選出參與成骨細(xì)胞分化的靶基因30個,并將這些基因3’UTR克隆入熒光素酶報告載體,與miR-494 mimics或N.C.共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,檢測其相對熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-494能顯著抑制BMPR2、FGFR2和Runx2 3’UTR報告基因的熒光素酶活性,且抑制效率達(dá)到40-60 %。相反地,突變掉這些基因上miR-494的結(jié)合位點后,miR-494對熒光素酶活性的影響消失,表明miR-494可以結(jié)合并作用于上述基因的3’UTR。Western Blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-494明顯抑制內(nèi)源性BMPR2、FGFR2和Runx2的蛋白和mRNA表達(dá)。為了進一步確定miR-494是通過抑制BMPR2、FGFR2和Runx2的表達(dá)影響成骨細(xì)胞分化,我們合成了針對這3個基因的siRNA。將3種siRNA分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞72小時,成骨細(xì)胞特異基因表達(dá)下調(diào),骨分化受抑制,其趨勢與轉(zhuǎn)染miR-494一致。我們的研究證明,miR-494通過直接下調(diào)和Runx2、BMPR2和FGFR2抑制成骨細(xì)胞的分化。 5.轉(zhuǎn)錄因子MyoD可能參與了對miR-494的表達(dá)調(diào)控。為了探討miR-494轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,我們對miR-494上游序列進行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果顯示,距離pre-miR-494 5’端2-3kb的上游序列在不同種屬中有高度的保守性,提示這段序列可能參與了對miR-494的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進一步的分析表明該區(qū)域有多個Myod的結(jié)合位點,提示轉(zhuǎn)錄因子Myod可能參與了miR-494的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們首先分析了模擬失重時,BMP-2誘導(dǎo)分化的C2C12細(xì)胞中Myod表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)隨著失重時間的延長,Myod表達(dá)發(fā)生了上調(diào),這與miR-494表達(dá)變化相一致。隨后,我們在正常重力條件下培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞中加入BMP-2,研究細(xì)胞分化過程中mi-494與Myod表達(dá)變化情況,Real-time PCR結(jié)果顯示兩者表達(dá)水平隨誘導(dǎo)時間的延長同時下降。此外,我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-494后,MyoD的表達(dá)水平也發(fā)生了上調(diào)。我們的研究初步顯示了轉(zhuǎn)錄因子MyoD可能參與了對miR-494的表達(dá)調(diào)控。為了證實我們的推測,進一步的的相關(guān)實驗還在深入進行中。 6. miR-494 inhibitor能夠部分緩解失重引起的成骨分化障礙。模擬失重時成骨細(xì)胞分化受抑制,miR-494表達(dá)升高。我們將針對miR-494的反義寡核苷酸,即miR-494 inhibitor及其相應(yīng)對照N.C. inhibitor分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,同時加入300 ng/ml BMP-2誘導(dǎo)分化,置于回轉(zhuǎn)器模擬失重培養(yǎng)72小時,用Real-time PCR方法檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)抑制miR-494的表達(dá)能夠使ALP染色增強,說明miR-494 inhibitor能夠增加骨形成能力,部分緩解失重引起的成骨分化障礙。 總之,我們發(fā)現(xiàn)miRNA參與失重性成骨細(xì)胞功能異常的發(fā)生。其中,我們對表達(dá)上調(diào)的miR-494功能和作用機制進行了較為全面的研究,發(fā)現(xiàn)在模擬失重時miR-494表達(dá)升高,而且與失重時間正相關(guān)。體外實驗證明,miR-494通過降低其靶基因BMPR2、FGFR2和Runx2的表達(dá)參與成骨細(xì)胞分化。過表達(dá)miR-494抑制成骨相關(guān)基因的表達(dá),從而抑制骨形成;降低內(nèi)源性miR-494表達(dá)則促進成骨分化,并且能夠部分緩解由于失重引起的成骨分化障礙。該研究將對預(yù)防和治療失重性骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R85

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本文編號：1157811