本文關(guān)鍵詞：模擬微重力下的血清miRNAs研究

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【摘要】：長期空間飛行過程中,由于重力的消失迫使機體的多種組織和器官去適應(yīng)新的微重力環(huán)境,從而產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性變化,稱之為“空間適應(yīng)綜合癥”。這些航天醫(yī)學問題已成為人類長期太空探索的重要障礙之一,主要包括骨丟失、認知功能損傷、肌肉萎縮、心血管功能紊亂等。航天微重力環(huán)境對航天員的生理健康和任務(wù)執(zhí)行造成了嚴重影響,如何對這些影響進行監(jiān)測和防護并揭示其機制,是航天醫(yī)學研究的首要任務(wù)。開發(fā)簡單有效的檢測指標對于航天員的生理健康監(jiān)測具有重要意義。同時,以系統(tǒng)生物學的思維來探索微重力對機體動態(tài)的、全身性的影響,將是航天醫(yī)學問題研究的有效手段。本論文以尾吊大鼠作為主要的動物模型,通過對血清miRNAs表達譜的研究來探索模擬微重力對機體的影響,獲得以下主要結(jié)果：首先對血清miRNAs的內(nèi)參基因進行了篩選和驗證。通過miRNAs芯片篩選,并結(jié)合多批次、大樣本的qPCR及2個專業(yè)內(nèi)參篩選軟件(geNorm和Normfinder)的運算分析,確定了miR-25-3p是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。進一步分析表明,miR-25-3p是一個在不同物種間高度保守的基因。它在大鼠尾吊、獼猴臥床等模擬微重力模型,以及大鼠OVX、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等模型中的表達均有很好的穩(wěn)定性,從而最終確定miR-25-3p可作為這些模型中穩(wěn)定的血清miRNAs內(nèi)參基因。這些結(jié)果為后續(xù)開展的的血清miRNAs研究奠定了基礎(chǔ)。隨后我們對失重性骨丟失和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的血清miRNAs標志物進行了篩選。利用大鼠OVX血清miRNAs芯片技術(shù)高通量篩選差異表達的miRNAs,并經(jīng)qPCR驗證得到15個下調(diào)的miRNA。進一步結(jié)合臨床樣本檢測后發(fā)現(xiàn),其中miR-30b-5p在骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松病人血清中都顯著下調(diào),miR-103-3p、 miR-142-3p和miR-328-3p在骨質(zhì)疏松病人血清中顯著下調(diào)。偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)它們與H-BMD之間均存在顯著的正相關(guān),而且miR-30b-5p和miR-142-3p還同時與]N-BMD顯著相關(guān)。這4個niRNAs可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的生物標志物。利用獼猴臥床實驗對模擬失重性骨丟失的標志物進行了鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p在臥床后獼猴血清中的表達顯著下降,ROC曲線分析表明它們有很好的診斷價值,但miR-328-3p未發(fā)生顯著變化。從而確定miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p可作為模擬失重性骨丟失的標志物。miRNA表達譜和代謝組學數(shù)據(jù)都包含了生理變化的重要信息,為了對數(shù)據(jù)進行深度挖掘,我們進行了二者的聯(lián)合分析。血清miRNAs芯片和qPCR檢測確定了13個在尾吊4周和5周后大鼠血清中均上調(diào)的miRNAs,pather和DAVID軟件的分析表明它們與神經(jīng)系統(tǒng),尤其是海馬高度相關(guān)。連續(xù)尾吊5周后,血清代謝組發(fā)生顯著性變化,與變化miRNAs的預(yù)測靶基因進行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),模擬失重對機體的神經(jīng)系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)有顯著影響。根據(jù)生物信息學分析結(jié)果,我們檢測了尾吊大鼠海馬組織miRNA、mRNA和蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)miR-383-5p的表達顯著上調(diào),同時其預(yù)測靶基因AQP4的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào),推測它可能直接受miR-383-5p的靶向調(diào)控。通過體外雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?確認了AQP4是miR-383-5p的靶基因。AQP4是調(diào)節(jié)腦組織水平衡的重要蛋白,也與海馬的學習記憶和認知功能密切相關(guān)。因此,推測它的變化是微重力影響海馬功能的潛在機制之一,并可能與微重力下的血液頭向分布相關(guān)。綜上所述,我們通過對血清miRNAs的研究發(fā)現(xiàn)：miR-25-3p是模擬微重力模型和骨質(zhì)疏松模型穩(wěn)定的內(nèi)參基因；并篩選得到一組血清miRNAs可作為模擬失重性骨丟失和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在標志物；最后對模擬微重力導致的認知功能損傷進行了初步的機制探索。
【關(guān)鍵詞】：微重力 血清miRNAs 生物標志物 骨質(zhì)疏松 代謝組學 海馬 認知功能 AQP4
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R85
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略表12-20
• 第一章 緒論20-50
• 1.1 長期空間飛行面臨的航天醫(yī)學問題20-26
• 1.1.1 失重對骨的影響20-22
• 1.1.2 失重對認知功能的影響22-24
• 1.1.3 失重對體液循環(huán)的影響24-25
• 1.1.4 失重對其他生理系統(tǒng)的影響25
• 1.1.5 組學在航天醫(yī)學研究中的應(yīng)用25-26
• 1.2 miRNAs概述26-29
• 1.2.1 miRNAs的發(fā)現(xiàn)26-27
• 1.2.2 miRNAs對骨的調(diào)控作用27-28
• 1.2.3 miRNA與海馬認知功能28-29
• 1.3 循環(huán)miRNAs概述29-37
• 1.3.1 循環(huán)miRNAs的發(fā)現(xiàn)29-30
• 1.3.2 循環(huán)miRNAs的特點30
• 1.3.3 循環(huán)miRNAs的存在形式與分泌機制30-32
• 1.3.4 循環(huán)miRNAs的內(nèi)參研究32-33
• 1.3.5 循環(huán)miRNAs與疾病診斷33-35
• 1.3.5.1 循環(huán)miRNAs作為疾病的生物標志物33-34
• 1.3.5.2 循環(huán)miRNAs作為骨質(zhì)疏松的生物標志物34-35
• 1.3.6 循環(huán)miRNAs作為信號分子參與組織或細胞間相互調(diào)控35-37
• 1.3.7 循環(huán)miRNAs的組學研究37
• 1.4 總結(jié)37-38
• 參考文獻38-50
• 第二章 血清miRNAs內(nèi)參基因的篩選與鑒定50-79
• 2.1 引言50-51
• 2.2 實驗材料51-54
• 2.2.1 實驗動物與樣品51
• 2.2.2 實驗儀器與耗材51-52
• 2.2.3 實驗試劑52-53
• 2.2.4 溶液配制53-54
• 2.3 實驗方法54-65
• 2.3.1 動物模型的建立54-56
• 2.3.1.1 大鼠尾吊模型的建立54
• 2.3.1.2 大鼠卵巢摘除模型的建立54-55
• 2.3.1.3 獼猴頭低位臥床模型的建立55-56
• 2.3.2 實驗動物取材56-57
• 2.3.2.1 血液采集和血清分離56
• 2.3.2.2 大鼠后肢骨分離56-57
• 2.3.3 原代顱骨成骨細胞分離培養(yǎng)與骨向誘導57
• 2.3.4 原代骨髓單核細胞破骨細胞向誘導分化57-58
• 2.3.5 μCT檢測分析58
• 2.3.6 miRNAs的提取58-62
• 2.3.6.1 血清miRNAs的提取58-59
• 2.3.6.2 細胞總RNAs的提取59-60
• 2.3.6.3 大鼠股骨總RNAs的提取60-61
• 2.3.6.4 總RNAs的質(zhì)量檢測61-62
• 2.3.7 尾吊大鼠血清miRNAs芯片檢測62-63
• 2.3.8 miRNA的表達檢測63-65
• 2.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析65
• 2.4 實驗結(jié)果65-73
• 2.4.1 大鼠尾吊模型的建立65-66
• 2.4.2 血清miRNAs候選內(nèi)參基因的選擇66-67
• 2.4.3 血清miRNAs內(nèi)參基因的選擇與驗證67-70
• 2.4.4 miR-25-3p是模擬微重力模型穩(wěn)定的血清miRNAs內(nèi)參基因70-71
• 2.4.5 miR-25-3p作為內(nèi)參基因在骨質(zhì)疏松模型中的穩(wěn)定性71-73
• 2.5 討論73-75
• 2.6 本章小結(jié)75
• 參考文獻75-79
• 第三章 骨質(zhì)疏松血清miRNAs標志物的篩選79-95
• 3.1 引言79-80
• 3.2 實驗材料80-81
• 3.2.1 實驗動物與樣品80
• 3.2.2 實驗儀器與耗材80
• 3.2.3 實驗試劑80-81
• 3.3 實驗方法81-83
• 3.3.1 血清樣品的獲取81
• 3.3.2 OVX大鼠血清miRNAs芯片檢測81
• 3.3.3 血清miRNA的提取與檢測81-82
• 3.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析82-83
• 3.4 實驗結(jié)果83-89
• 3.4.1 大鼠OVX模型中差異表達的血清miRNAs83-84
• 3.4.2 血清miRNAs作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在標志物84-87
• 3.4.3 血清miRNAs作為模擬失重性骨丟失的潛在標志物87-89
• 3.5 討論89-91
• 3.6 本章小結(jié)91
• 參考文獻91-95
• 第四章 血清miRNAs表達譜與代謝組學的聯(lián)合分析95-106
• 4.1 引言95
• 4.2 實驗材料95-96
• 4.2.1 實驗動物與樣品95
• 4.2.2 實驗儀器與耗材95-96
• 4.2.3 實驗試劑96
• 4.3 實驗方法96-98
• 4.3.1 血清樣品的獲取與檢測96
• 4.3.2 血清代謝組學檢測96-98
• 4.3.2.1 血清樣本預(yù)處理96-97
• 4.3.2.2 血清樣本LC-MS分析97
• 4.3.2.3 血清樣本數(shù)據(jù)預(yù)處理97
• 4.3.2.4 數(shù)據(jù)多變量分析和代謝標志物鑒定97-98
• 4.3.3 生物信息學分析98
• 4.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析98
• 4.4 實驗結(jié)果98-104
• 4.4.1 大鼠尾吊模型中差異表達的血清miRNAs98-102
• 4.4.2 尾吊大鼠血清代謝組的檢測與分析102-103
• 4.4.3 尾吊大鼠血清miRNAs芯片和代謝組的聯(lián)合分析103-104
• 4.5 討論104
• 4.6 本章小結(jié)104-105
• 參考文獻105-106
• 第五章 大鼠尾吊模擬微重力對海馬的影響106-126
• 5.1 引言106
• 5.2 實驗材料106-109
• 5.2.1 實驗動物與細胞106-107
• 5.2.2 實驗儀器與耗材107
• 5.2.3 實驗試劑107-109
• 5.2.4 溶液配制109
• 5.3 實驗方法109-116
• 5.3.1 mRNAs的表達檢測109-111
• 5.3.2 組織/細胞蛋白提取111-112
• 5.3.2.1 海馬組織蛋白提取111-112
• 5.3.2.2 細胞蛋白提取112
• 5.3.2.3 蛋白濃度測定112
• 5.3.3 AQP4基因3'-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建112-115
• 5.3.3.1 AQP4的3'-UTR擴增112-113
• 5.3.3.2 熒光素酶報告基因載體準備113-114
• 5.3.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建114-115
• 5.3.4 Western blot檢測蛋白表達115
• 5.3.5 細胞轉(zhuǎn)染115-116
• 5.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測116
• 5.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析116
• 5.4 實驗結(jié)果116-121
• 5.4.1 尾吊模擬微重力對大鼠海馬組織miRNAs/mRNAs表達的影響116-119
• 5.4.2 尾吊模擬微重力對大鼠海馬組織蛋白表達的影響119-120
• 5.4.3 AQP4是miR-383-5p的靶基因120-121
• 5.5 討論121-123
• 5.6 本章小結(jié)123
• 參考文獻123-126
• 第六章 結(jié)論與展望126-128
• 附錄Ⅰ128-129
• 附錄Ⅱ129

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