本文關(guān)鍵詞：拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞分化與凋亡的影響及其機制研究

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【摘要】：研究背景和目的 骨骼是機體中重要的承重組織，力學(xué)刺激下的骨組織主要通過動態(tài)的骨重建過程來調(diào)節(jié)其新陳代謝，從而適應(yīng)新的力學(xué)環(huán)境。骨重建過程是人類進化的一種重要的生理反應(yīng)，可以減少骨組織中骨量的流失，并保證骨組織結(jié)構(gòu)的完整性。骨重建過程受到機體中多種因素的調(diào)控，如遺傳因素、激素水平、代謝環(huán)境及力學(xué)刺激等。大量的研究表明，力學(xué)載荷在骨重建過程中發(fā)揮了重要作用：生理性動態(tài)載荷可以促進骨組織形成，而缺乏這種力學(xué)刺激會導(dǎo)致骨量的大量流失，如廢用性骨質(zhì)疏松等。成骨細胞和破骨細胞是力學(xué)環(huán)境下骨重建過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，其中成骨細胞主要活性為促進骨形成，而破骨細胞主要活性為促進骨吸收。在不同的力學(xué)加載條件下，成骨細胞和破骨細胞均可直接感受力學(xué)信號，并轉(zhuǎn)化為不同的生物學(xué)信號，導(dǎo)致骨重建過程向骨形成或骨吸收方向發(fā)展，從而引起骨量的重新分配和骨結(jié)構(gòu)的重新排布。 目前認為，骨組織的力學(xué)生物學(xué)效應(yīng)主要通過骨重建過程中成骨細胞與破骨細胞間的功能轉(zhuǎn)化來進行調(diào)節(jié)，但關(guān)于力學(xué)載荷下成骨細胞與破骨細胞間的相互作用及其調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究通過建立成骨細胞與破骨細胞的體外共培養(yǎng)體系，觀察不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下，成骨細胞對破骨細胞分化與凋亡的影響，并探討力學(xué)載荷下成骨細胞調(diào)控破骨細胞分化、凋亡的作用機制。 研究內(nèi)容與方法 (1)建立成骨細胞與破骨細胞的體外共培養(yǎng)體系。 采用MC3T3-E1成骨樣細胞株與RAW264.7破骨前體細胞株，經(jīng)10-8mol/L的1α,25(OH)2維生素D3(1α,25(OH)2D3)及50ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)作用，進行體外成骨細胞與破骨細胞的誘導(dǎo)分化，并利用Transwell小室(口部直徑2.4cm、底部面積4.67cm2、底膜為0.4μm孔徑的聚酯半透膜)建立成骨細胞與破骨細胞的共培養(yǎng)體系。共培養(yǎng)6d后，通過細胞活性(MTT)實驗、堿性磷酸酶(ALP)活力測定及蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定共育體系中成骨細胞的增殖和分化活性；通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺藍(TB)染色、TRAP活性測定及掃描電鏡技術(shù)(SEM)鑒定共育體系中破骨細胞的分化活性及骨吸收功能。 (2)基底拉伸應(yīng)變對成骨細胞增殖與分化的影響。 采用四點彎曲力學(xué)加載裝置，對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激，加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d，根據(jù)不同的加載強度將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、5000με三組，通過成骨細胞的MTT細胞活性實驗、ALP活性測定及ALP染色觀察不同加載強度的拉伸應(yīng)變對成骨細胞的增殖與分化活性的影響。 (3)拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞分化的影響及其調(diào)控機制。 采用四點彎曲力學(xué)加載裝置，對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激，加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d，根據(jù)不同的加載強度將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、5000με三組，通過破骨細胞的HE染色、TRAP染色、TB染色及TRAP活性測定，觀察不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞分化活性的調(diào)控作用；通過骨板中骨吸收陷窩的檢測(TB染色)及破骨細胞中組織蛋白酶-K(Cath-k)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的活性測定(免疫化學(xué)染色、ELISA法)，觀察不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞骨吸收功能的影響。 采用四點彎曲力學(xué)加載裝置，對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激，加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d，根據(jù)不同的加載強度將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、5000με三組，通過RT-PCR、Western blot及免疫化學(xué)染色方法，檢測不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞RANKL、OPG及EphA2的表達情況，同時觀察破骨細胞中EphA2的表達及NF-κB通路中信號分子p65的磷酸化水平，探討不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞調(diào)控破骨細胞分化及骨吸收功能的分子機制。 (4)拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞凋亡的影響及其調(diào)控機制。 采用四點彎曲力學(xué)加載裝置，對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激，加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d，根據(jù)不同的加載強度及RANKL干預(yù)因子將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、2500με+RANKL、5000με、5000με+RANKL五組。通過流式細胞術(shù)，檢測各實驗組中破骨細胞的細胞凋亡率；通過Hoechst染色，觀察各實驗組中破骨細胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化；通過Western blot技術(shù)，檢測各實驗組中破骨細胞Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達情況，觀察不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞調(diào)控破骨細胞凋亡的分子機制。 研究結(jié)果 (1)成骨細胞與破骨細胞體外共育體系的建立 與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組成骨細胞在MTT實驗中的吸光度顯著下降(P0.01)；共培養(yǎng)組成骨細胞ALP活性顯著升高(P0.01)；HE染色后，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組成骨細胞無限增殖速度減慢，細胞數(shù)量減少。與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組破骨細胞TRAP活性顯著升高(P0.01)，TRAP染色明顯增強；共培養(yǎng)組可見多個成熟的破骨細胞，細胞體積增大，胞漿伸展、空泡化，并有多個細胞核；共培養(yǎng)組骨片上可見多個圓形的骨吸收陷窩，凹陷明顯，與周邊骨組織界限清楚。此結(jié)果顯示，共育體系中成骨細胞與破骨細胞的分化活性均明顯增強。 (2)基底拉伸應(yīng)變對成骨細胞增殖與分化的影響。 對成骨細胞施加基底拉伸應(yīng)變3d后，與0με組比較，2500με組可顯著提高成骨細胞的增殖活性，表現(xiàn)為MTT實驗中OD值顯著升高(P0.05)，2500με組可促進成骨細胞ALP活性的升高(P0.05)；而5000με組則降低成骨細胞的增殖活性(P0.05)與ALP活性(P0.05)；各實驗組中成骨細胞ALP染色結(jié)果與ALP定量分析結(jié)果一致。此結(jié)果顯示，生理性拉伸應(yīng)變可促進成骨細胞的增殖與分化，而超生理性拉伸應(yīng)變則抑制成骨細胞的增殖與分化。 (3)拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞分化的影響及其調(diào)控機制。 對成骨細胞施加拉伸應(yīng)變3d后，與0με組比較，2500με組可顯著抑制破骨細胞的分化和骨吸收功能，表現(xiàn)為多核破骨細胞的數(shù)量減少，TRAP活性降低(P0.05)，TRAP染色強度下降(P0.01)，骨片中骨吸收陷窩的面積減小(P0.01)，破骨細胞中Cath-k及MMP-9的表達降低(P0.05或P0.01)；5000με組中破骨細胞的TRAP活性、骨吸收陷窩面積及Cath-k、MMP-9的表達也顯著下降(P0.01)。此結(jié)果顯示，拉伸應(yīng)變作用成骨細胞后，抑制了破骨細胞的分化與骨吸收功能。 對成骨細胞施加拉伸應(yīng)變3d后，與0με組比較，2500με組可顯著升高成骨細胞中OPG mRNA及蛋白表達水平(P0.01)，而對RANKL mRNA及蛋白表達無顯著影響，由于OPG的高表達，2500με組可顯著上調(diào)成骨細胞中OPG/RANKL表達的比值(P0.01)；與0με組比較，5000με組可顯著升高成骨細胞中OPG mRNA及蛋白表達水平(P0.05)，同時升高RANKL mRNA及蛋白表達水平(P0.05)，且上調(diào)成骨細胞中OPG/RANKL表達的比值(P0.05)；與0με組比較，2500με及5000με組對成骨細胞中EphA2的表達均無顯著影響。此結(jié)果顯示，拉伸應(yīng)變作用成骨細胞后，對破骨細胞的抑制作用與上調(diào)成骨細胞OPG/RANKL表達的比值有關(guān)。 對成骨細胞施加拉伸應(yīng)變3d后，與0με組比較，2500με組可降低破骨細胞中p65磷酸化蛋白(p-p65)的表達(P0.05)，且OPG重組因子干預(yù)后可進一步抑制p-p65的表達(P0.01)，并降低TRAP活性(P0.01)；與0με組比較，2500με及5000με組對破骨細胞中EphA2的表達均無顯著影響。此結(jié)果顯示，拉伸應(yīng)變作用成骨細胞后，對破骨細胞的抑制作用與下調(diào)破骨細胞中p65的磷酸化水平有關(guān)。 (4)拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞凋亡的影響及其調(diào)控機制。 對成骨細胞施加拉伸應(yīng)變3d后，與0με組比較，2500με組可升高破骨細胞的凋亡率(P0.01)；與2500με組比較，，2500με+RANKL組則降低破骨細胞的凋亡率(P0.05)；與0με組比較，5000με組可升高破骨細胞的凋亡率(P0.01)；與5000με組比較，5000με+RANKL組則降低破骨細胞的凋亡率(P0.01)；各組破骨細胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化與凋亡率的檢測結(jié)果一致。此結(jié)果顯示，拉伸應(yīng)變作用成骨細胞后，促進了破骨細胞的凋亡發(fā)生，RANKL因子干預(yù)后可抑制破骨細胞的凋亡。 對成骨細胞施加拉伸應(yīng)變3d后，與0με組比較，2500με組可顯著促進破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P0.01)；與2500με組比較，2500με+RANKL組則顯著抑制破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P0.05或P0.01)；與0με組比較，5000με組可顯著促進破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P0.01)；與5000με組比較，5000με+RANKL組則顯著抑制破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P0.05或P0.01)。此結(jié)果顯示，拉伸應(yīng)變作用成骨細胞后，對破骨細胞的促凋亡機制與激活破骨細胞中Fas/FasL介導(dǎo)的細胞凋亡通路有關(guān)。 研究結(jié)論 (1) Transwell共育體系中成骨樣細胞的無限增殖能力減弱，而分化活性增強，同時破骨前體細胞被誘導(dǎo)分化為成熟的破骨細胞，并具有骨吸收功能。該共育體系可用于探討力學(xué)環(huán)境下骨重建中成骨細胞與破骨細胞間信號調(diào)控機制的實驗研究。 (2)生理性拉伸應(yīng)變(2500με)可促進成骨細胞的增殖和分化，繼而抑制共育體系中破骨細胞的分化及骨吸收功能，而超生理性拉伸應(yīng)變(5000με)則抑制成骨細胞的增殖和分化，同時抑制共育體系中破骨細胞的分化及骨吸收功能。不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用下，成骨細胞抑制共育體系中破骨細胞分化及骨吸收功能的作用機制，可能與上調(diào)成骨細胞中OPG/RANKL表達的比值，繼而抑制破骨細胞中NF-κB信號通路的激活有關(guān)。 (3)生理性拉伸應(yīng)變(2500με)作用成骨細胞后，可促進共育體系中破骨細胞的凋亡發(fā)生，超生理性拉伸應(yīng)變(5000με)作用成骨細胞后，亦可促進共育體系中破骨細胞的凋亡發(fā)生。不同加載強度的拉伸應(yīng)變作用成骨細胞后，對共育體系中破骨細胞的促凋亡機制，可能與上調(diào)成骨細胞中OPG/RANKL表達的比值，繼而激活破骨細胞中Fas/FasL介導(dǎo)的細胞凋亡通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：拉伸應(yīng)變 骨重建 共培養(yǎng) 成骨細胞 破骨細胞 分化 凋亡
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R82
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-17
• 第1章 緒論17-29
• 1.1 研究背景17-21
• 1.2 研究目的和意義21
• 1.3 研究內(nèi)容與方法21-24
• 1.4 課題實施方案24-26
• 1.5 參考文獻26-29
• 第2章 成骨細胞與破骨細胞體外共培養(yǎng)體系的建立29-37
• 2.1 材料和方法29-32
• 2.2 實驗結(jié)果32-34
• 2.3 討論34-35
• 2.4 本章小結(jié)35
• 2.5 參考文獻35-37
• 第3章 基底拉伸應(yīng)變對成骨細胞增殖與分化的影響37-45
• 3.1 材料和方法37-40
• 3.2 實驗結(jié)果40-42
• 3.3 討論42-43
• 3.4 本章小結(jié)43
• 3.5 參考文獻43-45
• 第4章 拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞分化的影響45-70
• 4.1 材料和方法46-51
• 4.2 實驗結(jié)果51-66
• 4.3 討論66-67
• 4.4 本章小結(jié)67
• 4.5 參考文獻67-70
• 第5章 拉伸應(yīng)變作用下成骨細胞對破骨細胞凋亡的影響70-82
• 5.1 材料和方法70-73
• 5.2 實驗結(jié)果73-79
• 5.3 討論79-80
• 5.4 本章小結(jié)80
• 5.5 參考文獻80-82
• 全文總結(jié)82-83
• 文獻綜述83-91
• 參考文獻88-91
• 在學(xué)期間取得的成果及發(fā)表的代表性論著91-112
• 作者簡歷112-113
• 致謝113

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李展春;戴力揚;;骨微損傷與骨重建[J];創(chuàng)傷外科雜志;2009年06期

本文編號：1043085