發(fā)布時間：2017-05-20 15:13

  本文關鍵詞：血凝酶—脂質體—微泡復合物的制備及其體外凝血的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 活動性出血是腹部實質臟器閉合性創(chuàng)傷急性致死的主要因素之一。目前常用的方法止血方法有外科手術、選擇性動脈栓塞以及射頻凝固等方法,但是它們具有的愈后差、操作復雜以及容易損傷創(chuàng)傷部位周圍正常組織等缺陷。因此我們擬探索一種更為簡便、有效以及無創(chuàng)的止血方式控制活動性出血。我們擬通過一種載體運載止血劑到達活動性出血部位,通過低機械指數(shù)超聲發(fā)現(xiàn)活動性出血部位,而后通過聚焦超聲激發(fā)載體釋放止血劑,從而達到止血目的。脂質體-微泡復合物集合了脂質體以及微泡的優(yōu)勢,既可以超聲顯影又可以運載藥物被超聲激發(fā)釋藥,然而將其用于止血的研究尚不多見。本研究擬采用此載體,將血凝酶包封于脂質體內并通過親和素-生物素系統(tǒng)將其與微泡相連,制備載止血劑的脂質體-微泡復合物,為實現(xiàn)腹部實質臟器閉合性創(chuàng)傷活動性出血的一體化診療新方法奠定基礎。 第一章脂質體包封血凝酶的實驗研究 研究目的： 研究脂質體包封血凝酶的可行性。 材料和方法： 1兩種逆相蒸發(fā)法的選擇 以DPPC (1,2-Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholine,二棕櫚酰磷脂酰膽堿)、CH (Cholesterol,膽固醇)、DSPE-PEG2000Biotin (1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Biotinyl (Polyethylene Glycol)-2000],生物素酞化聚乙二醇2000修飾二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)為原料,通過兩種逆相蒸發(fā)法包封血凝酶,檢測所得脂質體的粒徑,并對脂質體懸液的外觀進行觀察,初步評估脂質體濃度。4℃儲存12h、24h、36h后觀察脂質體懸液外觀變化,從而確定本實驗所用血凝酶的包封方法。 2脂質體包封血凝酶 將血凝酶凍干粉末溶解于去離子水中,于4℃進行透析處理,透析4.5h。將DPPC、CH、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩爾比60：40：5完全溶解于三氯甲烷中,加入15%三氯甲烷體積的無水乙醚。加入有機溶劑1/3體積的血凝酶溶液。對混合液進行聲振處理4min。將混合液真空條件下干燥處理1h。取干燥后混合液,14000g離心處理30min。取下層乳白色凝膠物以11mmol/1旨質濃度溶解于去離子水,充分混合均勻。 3理化性質檢測 通過納米粒度及電位分析儀檢測血凝酶-脂質體的粒徑以及表面電位；將血凝酶-脂質體懸液分別于室溫(25℃)及4℃靜置12h、24h、36h、48h,觀察脂質體懸液有無渾濁、沉淀及分層；梯度稀釋血凝酶溶液,按照BCA(Bicinchoninic Acid,二喹啉甲酸)蛋白濃度測定的方法,于562nm檢測吸光度,繪制血凝酶的標準曲線。通過公式計算包封率： W總代表脂質體懸液加入終濃度為1%的Triton X-100水溶液處理后至脂質體完全破裂溶液中的藥物總量。W游離代表未經(jīng)過處理前懸液中未包封的藥物含量。 結果： 第二種逆相蒸發(fā)法包封1單位/ml血凝酶的脂質體的濃度第一種逆相蒸發(fā)法包封2單位/ml血凝酶的脂質體的濃度第一種逆相蒸發(fā)法包封1單位/ml血凝酶的脂質體的濃度。第一種逆相蒸發(fā)法包封2單位/m1血凝酶的脂質體的粒徑第一種逆相蒸發(fā)法包封1單位/m1血凝酶的脂質體的粒徑第二種逆相蒸發(fā)法包封1單位/ml血凝酶的脂質體的粒徑。本研究選擇第二種逆相蒸發(fā)法制備血凝酶-脂質體,通過此方法獲得的血凝酶-脂質體懸液呈均一半透明狀態(tài),平均粒徑約(431.95±19.04)nm,表面電位為(-22.13±0.35)mv,并于室溫(25℃)及4℃靜置48h內無渾濁、沉淀及分層。 結論： 血凝酶可以通過逆相蒸發(fā)法被脂質體包封,粒徑為納米級,表面帶負電,具有良好的穩(wěn)定性,包封率為35.08%,為與微泡相連奠定了基礎。 第二章親和素-生物素法連接血凝酶-脂質體與微泡的實驗研究 研究目的： 研究親和素-生物素系統(tǒng)對連接血凝酶-脂質體與微泡的價值。 材料和方法： 1生物素化微泡的制備 將DSPC (1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine,二硬脂酰磷酯酰膽堿)、DSPE-PEG2000(1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000],聚乙二醇2000-二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩爾比90：5：5完全溶解于三氯甲烷中。將脂質溶液于65℃進行水浴處理,同時氮氣流下吹干處理,形成均勻脂質薄膜。對脂質薄膜干燥處理至完全干燥。將Tris緩沖液加入脂質薄膜內。將水合后的脂質溶液于65℃恒溫進行聲振處理。反復多次將C3F8(Perfluoropropane,全氟丙烷)通入溶液中直至呈飽和狀態(tài)。通過機械振蕩換氣后的脂質溶液,形成生物素化微泡。 2生物素化微泡的理化性質檢測 通過顆粒計數(shù)分析儀檢測生物素化微泡的粒徑及濃度；通過納米粒度及電位分析儀檢測生物素化微泡的表面電位；通過倒置系統(tǒng)顯微鏡明視野下觀察生物素化微泡的形態(tài)與分布；將生物素化微泡放置于4℃儲存,分別于制備后即刻、24h、48h、72h、1周后,通過顆粒計數(shù)分析儀檢測生物素化微泡的粒徑及濃度變化。 3血凝酶-脂質體與生物素化微泡的連接及驗證 3.1磁性微泡的制備及磁性吸附觀察 將純化后的生物素化微泡與親和素孵育連接后,再與等體積的生物素化的右旋糖苷氧化鐵納米粒孵育30min,得到磁性微泡。 將磁性微泡注入透明軟管內,將透明軟管靜置5min,用超聲實時分子影像系統(tǒng)實時觀察磁性微泡的運動變化及顯影情況。在與磁性微泡運動方向相反的方向放置永磁鐵。待永磁鐵放置5min后,觀察磁性微泡的運動變化及顯影情況。采用PBS (Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩沖液)作為空白對照。 3.2FITC標記血凝酶的脂質體-微泡復合物的制備及連接觀察 將2單位/1的血凝酶溶液與1mmol/1的FITC (Fluorescein Isothiocyanate,異硫氰酸熒光素)水溶液于4℃避光孵育10h。而后透析處理。將DPPC、CH、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩爾比60：40：5溶解于三氯甲烷中,加入15%三氯甲烷體積的無水乙醚。加入有機溶劑1/3體積的FITC標記的血凝酶溶液。對混合液進行聲振處理4min。將混合液真空條件下干燥處理1h。取干燥后混合液14000g離心處理30min。取下層黃綠色凝膠物以11mmol/1脂質濃度溶解于去離子水,充分混合均勻。將1m1生物素化微泡用去離子水以300g離心3min,洗滌4次。而后將生物素化微泡與過量親和素溶液孵育15min。用去離子水以300g離心3min,洗滌4次。將上述已連接親和素的生物素化微泡與500u1FITC標記血凝酶的脂質體懸液孵育15min。用去離子水將上述FITC標記血凝酶的脂質體-微泡復合物懸液以300g離心3min,洗滌數(shù)次,直至洗滌液澄清,呈無色。 將FITC標記血凝酶的脂質體-微泡復合物經(jīng)過去離子水稀釋后,于倒置系統(tǒng)顯微鏡下進行形態(tài)及熒光性觀察。 4血凝酶-脂質體與微泡添加比例的實驗 純化生物素化微泡,將其與親和素連接。將連接親和素后的等量生物素化微泡分別與250μl和500μl血凝酶-脂質體懸液孵育,得到血凝酶-脂質體-微泡復合物,并純化血凝酶-脂質體-微泡復合物。對其粒徑及濃度進行檢測,從而分析生物素化微泡與血凝酶-脂質體比例對血凝酶-脂質體-微泡復合物的粒徑及濃度的影響。 5血凝酶-脂質體-微泡復合物的理化性質檢測 將血凝酶-脂質體-微泡復合物置于顆粒計數(shù)分析儀內進行粒徑及濃度檢測。將血凝酶-脂質體-微泡復合物經(jīng)過去離子水稀釋后加入納米粒度及電位分析儀內進行表面電位檢測。將純化后的血凝酶-脂質體-微泡復合物經(jīng)過去離子水稀釋后于倒置系統(tǒng)顯微鏡明視野下觀察其形態(tài)與分布。取血凝酶-脂質體-微泡復合物共400μl,每100μl吸入1ml注射器內,將4只注射器分別以0、125μl/min,500μl/min,1000μl/min的速度進行推注,并收集推注后的懸液,取懸液下層清液,將其與BCA蛋白濃度測定試劑反應后,于562nm檢測吸光度,從而分析推注速度對血凝酶-脂質體-微泡復合物的穩(wěn)定性的影響。將血凝酶-脂質體-微泡復合物(濃度數(shù)量級為109個/ml)及用去離子水分別稀釋10倍(濃度數(shù)量級為108個/ml)、100倍(濃度數(shù)量級為107個/ml)、103倍(濃度數(shù)量級為106個/ml)、104倍(濃度數(shù)量級為105個/ml)、105倍(濃度數(shù)量級為104個/ml)、106倍(濃度數(shù)量級為103個/ml)后裝入7組透明離心管內,另外將1組透明離心管內裝入等量去離子水作為空白對照組。對8組透明離心管進行超聲實時顯影,實時記錄和觀察血凝酶-脂質體-微泡復合物隨濃度變化的顯影特點,并通過各組感興趣區(qū)的灰階值測量對血凝酶-脂質體-微泡復合物的聲學性質進行評價。 結果： 生物素化微泡的平均粒徑約為(1.11±0.21)μm,濃度約為(2.79±1.64)×109個/m1,表面電位為(-24.10±1.01)mv,顯微鏡下呈圓形,中心透亮,分布較均勻,無粘附聚集。4℃下,其粒徑隨著時間變化而逐漸增大,濃度隨著時間變化而逐漸減低。 磁性微泡具有超聲增強顯影效果并且因為具有順磁性而可以被永磁鐵吸附移動。FITC標記血凝酶的脂質體-微泡復合物于熒光激發(fā)下可見呈圓形,中心透亮,外周被黃綠色熒光所包繞,這些結果證實親和素-生物素系統(tǒng)可以將血凝酶-脂質體與生物素化微泡進行有效的連接。 等量生物素微泡連接250u1和500u1血凝酶-脂質體對血凝酶-脂質體-微泡復合物的粒徑的影響無顯著性意義。本實驗最終選用500μl血凝酶-脂質體懸液加入量制備血凝酶-脂質體-微泡復合物。所得血凝酶-脂質體-微泡復合物的平均粒徑約為(4.01±0.40)u m,濃度約(1.80±0.48)×109個/ml,表面電位為(-27.87±0.68)mv。顯微鏡下呈圓形,中心透亮,分布較均勻,無粘附聚集。125μl/min以內的推注速度引起血凝酶-脂質體-微泡復合物的滲漏可以忽略不計,而500μl/min、1000μl/min的推注速度均可以引起血凝酶-脂質體-微泡復合物的明顯滲漏。將血凝酶-脂質體-微泡復合物稀釋100倍(濃度數(shù)量級為107個/ml)、103倍(濃度數(shù)量級為106個/ml)、104倍(濃度數(shù)量級為105個/ml)時為適宜顯影濃度,增強回聲均勻,既不會因為聲影產生而影響圖像顯影,也不會因為濃度過度導致灰階值變化明顯。 結論： 親和素-生物素系統(tǒng)是一種有效的連接方式,它可以將包封血凝酶的脂質體牢固地連接于微泡表面,形成的血凝酶-脂質體-微泡復合物,理化性質較穩(wěn)定。 第三章超聲激發(fā)血凝酶-脂質體-微泡復合物體外凝血實驗研究目的： 研究超聲激發(fā)血凝酶-脂質體-微泡復合物釋藥體外凝血的效果。材料和方法： 將1m1生物素化微泡以300g離心3min,洗滌4次。將純化后的生物素化微泡與過量的親和素溶液孵育15min。以300g離心3min,洗滌4次,離心洗滌過量游離親和素。將連接親和素后的生物素化微泡與500μl血凝酶-脂質體懸液孵育15min得到血凝酶-脂質體-微泡復合物。以300g離心3min,洗滌4次純化。 將血凝酶-脂質體-微泡復合物用去離子水稀釋10倍后取100u1,通過2.25MHz聚焦超聲用4.17w/cm2和8.34w/cm2分別對血凝酶-脂質體-微泡復合物激發(fā)30s,加入450μl兔血漿。而后加入40mg/ml CaCl2(Calcium Chloride,氯化鈣)啟動凝血過程,分別于25℃和37℃用1m1注射器的針頭在同樣的方向和深度以挑取纖維蛋白為標準計算凝血時間。以去離子水及血凝酶-脂質體-微泡復合物不通過超聲處理組作為對照組。 結果： 凝血時間：去離子水組血凝酶-脂質體-微泡復合物組血凝酶-脂質體-微泡復合物通過4.17w/cm2超聲激發(fā)組血凝酶-脂質體-微泡復合物通過8.34w/cm2超聲激發(fā)組。25℃時的凝血時間37℃時的凝血時間。血凝酶-脂質體-微泡復合物能夠縮短凝血時間,對血凝酶-脂質體-微泡復合物進行超聲激發(fā)處理后,超聲可以激發(fā)微泡促進相連的脂質體釋放被包封的血凝酶。此連接方式并沒有影響血凝酶的凝血功能,并且超聲處理時增大聲強(8.34w/cm2),能夠增加藥物釋放,而表現(xiàn)為進一步縮短凝血時間。此外,37℃的體外凝血實驗較25℃時相比具有更明顯的實驗效果。 結論： 血凝酶-脂質體-微泡復合物在聚焦超聲激發(fā)下可以明顯縮短凝血時間,37℃的體外凝血實驗較25℃時相比具有更明顯的實驗效果,該結果為后期的動物實驗奠定了基礎。
【關鍵詞】：脂質體 血凝酶 逆相蒸發(fā)法 脂質體 微泡 血凝酶 親和素 生物素 超聲 脂質體 微泡 血凝酶 凝血
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R656.1;R816.5
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-30
• 第一章 脂質體包封血凝酶的實驗研究30-43
• 1 材料與方法30-33
• 2 結果33-39
• 3 討論39-42
• 4 結論42-43
• 第二章 親和素-生物素法連接血凝酶-脂質體與微泡的實驗研究43-63
• 1 材料與方法43-48
• 2 結果48-59
• 3 討論59-62
• 4 結論62-63
• 第三章 超聲激發(fā)血凝酶-脂質體-微泡復合物體外凝血實驗63-68
• 1 材料和方法63-65
• 2 結果65-66
• 3 討論66-67
• 4 結論67-68
• 參考文獻68-75
• 縮略詞表75-76
• 攻讀學位期間所取得成果76-79
• 致謝79-80

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：血凝酶—脂質體—微泡復合物的制備及其體外凝血的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：382003