目的:法醫(yī)物證檢驗(yàn)涉及到最常見(jiàn)的生物檢材之一是精液和陰道液混合斑,從混合斑中分離出男性的特有成分精子是目前性犯罪案件的難點(diǎn)。針對(duì)混合斑分離精液和陰道液組分進(jìn)行檢測(cè)以及精液特有成分檢測(cè)的方法有多種,但是有時(shí)會(huì)因?yàn)榕猿煞秩珀幍郎掀ぜ?xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)多于精子數(shù)量,造成了獲得精子難度提升,或者即使獲得但是精子不完整或者并非單一成分,這導(dǎo)致后續(xù)提取精子DNA難度加大,更無(wú)法進(jìn)行個(gè)人識(shí)別鑒定。卵膜糖蛋白,也叫透明帶(zona pellucida,ZP)是一種包裹在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞周圍的糖蛋白半透明基質(zhì),在受精過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在人類中,ZP由四種糖蛋白組成,分別為ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。其中,hZP3是精卵識(shí)別結(jié)合的初級(jí)受體,在受精過(guò)程中,與精子結(jié)合,誘發(fā)精子一系列反應(yīng),包括精子膜活化、酪氨酸磷酸化和頂體反應(yīng)等,在精卵結(jié)合、頂體反應(yīng)、防止多精入卵以及保護(hù)卵細(xì)胞和著床前的胚胎等方面發(fā)揮著重要的作用。hZP3的功能肽段,氨基酸序列214-305aa,(命名為Truncated ZP3(TrZP3))是誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)的關(guān)鍵肽段。研究已經(jīng)證明重組hZP3和TrZP3在結(jié)構(gòu)和功能上與天然ZP3接...

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
第一部分:重組人卵膜糖蛋白3在真核細(xì)胞中的表達(dá)及與精子體外結(jié)合的探討
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 重組質(zhì)粒DNA提取和酶切驗(yàn)證
            2.2.2 真核細(xì)胞HEK293 培養(yǎng)
            2.2.3 真核細(xì)胞HEK293 轉(zhuǎn)染
            2.2.4 細(xì)胞蛋白提取和濃度測(cè)定
            2.2.5 hZP3 純化
            2.2.6 hZP3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)
            2.2.7 純化hZP3 ELISA法檢測(cè)
            2.2.8 精子樣品制備
            2.2.9 純化hZP3 與精子體外結(jié)合檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 重組hZP3 蛋白在真核細(xì)胞中成功表達(dá)
            3.1.1 重新培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)裂解純化后成功獲得重組質(zhì)粒
            3.1.2 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中得到高效表達(dá)
            3.1.3 利用標(biāo)簽蛋白純化獲得了hZP3-His融合蛋白
        3.2 重組hZP3 蛋白與精子體外結(jié)合
            3.2.1 純化的hZP3-His融合蛋白與特異性抗體結(jié)合具有劑量效應(yīng)
            3.2.2 純化的hZP3-His融合蛋白與精子體外未觀察到明顯結(jié)合
    4 討論
        4.1 融合蛋白hZP3-His在真核細(xì)胞HEK293 中的表達(dá)
        4.2 融合蛋白hZP3-His與精子體外結(jié)合的探究
    5 結(jié)論
第二部分:穩(wěn)定表達(dá)人ZP3(214-305aa)CHO系的建立及ZP3(214-305aa)與精子體外結(jié)合的研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 重組質(zhì)粒DNA的提取
            2.2.2 真核細(xì)胞CHO-K1 培養(yǎng)
            2.2.3 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細(xì)胞系構(gòu)建
            2.2.4 TrZP3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)
            2.2.5 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細(xì)胞熒光顯微鏡觀察
            2.2.6 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)
            2.2.7 TrZP3 純化
            2.2.8 純化TrZP3 ELISA法檢測(cè)
            2.2.9 純化TrZP3 與梯度精子體外結(jié)合檢測(cè)
            2.2.10 純化TrZP3 與精子體外梯度時(shí)間結(jié)合檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 穩(wěn)定表達(dá)hZP3(214-305aa)CHO細(xì)胞系構(gòu)建成功
            3.1.1 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞CHO中得到穩(wěn)定表達(dá)
            3.1.2 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好
            3.1.3 融合蛋白EGFP-TrZP3-6His在穩(wěn)定細(xì)胞的胞質(zhì)中均勻表達(dá)
            3.1.4 利用His標(biāo)簽蛋白純化獲得了融合蛋白EGFP-TrZP3-6His
        3.2 hZP3(214-305aa)與精子體外結(jié)合
            3.2.1 純化獲得的融合蛋白與抗GFP抗體結(jié)合表現(xiàn)出劑量效應(yīng)
            3.2.2 純化的融合蛋白與梯度精子在體外未檢測(cè)到結(jié)合
            3.2.3 純化的融合蛋白與精子體外孵育不同時(shí)間未檢測(cè)到結(jié)合
    4 討論
        4.1 穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建和融合蛋白EGFP-ZP3-6His表達(dá)
        4.2 融合蛋白EGFP-TrZP3-6His與精子體外結(jié)合的研究
    5 結(jié)論
第三部分:三個(gè)常染色體InDel遺傳標(biāo)記的多態(tài)性調(diào)查及與帕金森病相關(guān)性分析
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 研究對(duì)象
        2.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
            2.2.1 主要試劑與耗材
            2.2.2 主要儀器
        2.3 實(shí)驗(yàn)方法
            2.3.1 基因組DNA分離和基因分型
            2.3.2 GIGYF2 的毛細(xì)管電泳
            2.3.3 DNA測(cè)序
            2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 ACE和 DJ-1 InDel多態(tài)性的基因分型
        3.2 GIGYF2 基因的InDel與 PD相關(guān)
        3.3 PD相關(guān)的InDel基于性別的遺傳分布差異
        3.4 三個(gè) InDel 位點(diǎn)的法醫(yī)學(xué)參數(shù)
    4 討論
        4.1 三個(gè)InDel遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)意義
        4.2 三種不同的InDel與 PD關(guān)聯(lián)性
            4.2.1 ACE的 InDel多態(tài)性與PD關(guān)聯(lián)性
            4.2.2 DJ-1的InDel多態(tài)性與PD關(guān)聯(lián)性
            4.2.3 GIGYF2的InDel多態(tài)性與PD關(guān)聯(lián)性
            4.2.4 三種InDel多態(tài)性性別分層與PD關(guān)聯(lián)性
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3804276