本文關(guān)鍵詞：線粒體單核苷酸多態(tài)性AS-PCR復(fù)合檢測體系的建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,從被稱為第一代遺傳標記的DNA指紋技術(shù),到當(dāng)前法庭科學(xué)主流使用的熒光標記PCR-STR復(fù)合擴增技術(shù),再到被稱為第三代遺傳標記的SNP技術(shù),DNA鑒定在法庭科學(xué)中發(fā)揮著日益重要的作用。在法醫(yī)學(xué)實踐中多是檢測遵循孟德爾遺傳定律的常染色體STR以及遵循父系遺傳的Y染色體STR,然而常規(guī)STR分型系統(tǒng)并不是在每個案件中都能發(fā)揮作用——如高度降解的DNA樣本、無核樣本以及需要進行母系親緣關(guān)系鑒定的樣本等。在這種情況下,檢測遵循母系遺傳的線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)則十分有意義。mtDNA是人類基因組的重要組成部分,共含有16569個堿基對,為一條雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子,分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)(控制區(qū)),其中控制區(qū)包含有高變I區(qū)(Hypervariable Region I, HVI)和高變II區(qū)(Hypervariable Region II, HVII),編碼區(qū)內(nèi)則含有散在的SNP位點。與核基因組相比,mtDNA位于核外,具有多拷貝、高突變率、母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組等特點,使其在法醫(yī)學(xué)、群體遺傳學(xué)、人類生態(tài)學(xué)、分子進化和考古學(xué)中具有重要的應(yīng)用價值。在法醫(yī)學(xué)實踐中,常規(guī)的mtDNA檢測方法是對HVI和HVII進行直接測序,然而測序步驟繁瑣費時,對DNA模板要求較高,有時需重復(fù)測序,且區(qū)段有限,影響個體識別率。近年來,隨著對人類起源進化以及群體遺傳學(xué)的研究,世界各地大量的線粒體全序列數(shù)據(jù)被報導(dǎo),并以此為基礎(chǔ)依照不同的SNP分型構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹,定義線粒體單倍型,為人類進化、考古學(xué)以及法醫(yī)學(xué)等研究提供了基礎(chǔ)框架。依據(jù)進化樹選擇決定單倍型的SNP位點進行檢測成為mtDNA檢測的趨勢。目前國內(nèi)外已建立起來的mtDNA SNP分型的方法主要有PCR-RFLP、 DHPLC、焦磷酸測序法、SNaPshot以及等位基因特異性PCR(AS-PCR)等技術(shù)。其中AS-PCR技術(shù)是基于引物3’端堿基對擴增反應(yīng)的開關(guān)作用,通過對引物的巧妙設(shè)計來達到有效分析單核苷酸多態(tài)性的目的,與PCR-RFLP、DHPLC、SNaPshot等方法相比具有操作簡便、耗時短、成本低、結(jié)果亦可靠等優(yōu)點。本課題依據(jù)最新的系統(tǒng)進化樹篩選mtDNA SNP位點,應(yīng)用AS-PCR結(jié)合毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)檢測技術(shù),建立了一套簡便快速、適用于中國人群且可投入法醫(yī)學(xué)實際應(yīng)用的線粒體SNP復(fù)合擴增檢測體系。目的為法醫(yī)學(xué)實踐提供線粒體SNP快速、簡便而可靠的檢測手段,篩選60個針對中國人群單倍型的位點,應(yīng)用AS-PCR結(jié)合CE,建立一套四色熒光標記復(fù)合擴增檢測體系,并對其可行性進行評估；應(yīng)用該體系對200例漢族無關(guān)個體以及200例維吾爾族無關(guān)個體進行單倍型頻率調(diào)查以及人群遺傳關(guān)系比較,為群體遺傳學(xué)提供新的數(shù)據(jù)；同時將該體系應(yīng)用于實際案件中,探討其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。方法篩選60個線粒體SNP位點,分為三組�；贏S-PCR原理,自行設(shè)計具有長度差異的上游(下游)等位基因特異性引物及下游(上游)通用引物,各組通用引物的5’端分別標記藍色6-FAM、綠色HEXTM以及黃色TAMRATM熒光。通過正交法對體系中各組分以及PCR反應(yīng)的參數(shù)進行調(diào)整,建立三組復(fù)合檢測體系。應(yīng)用直接測序法對該方法進行驗證。為保證SNP分型的重復(fù)性和準確性,開發(fā)了SNP標準分型階梯(ladder)。用建立的體系對200份漢族無關(guān)個體以及200份維吾爾族無關(guān)個體進行檢測分型,計算各種單倍型的頻率。進一步收集其他人群單倍型頻率數(shù)據(jù),用Arlequin v3.1軟件進行人群比較分析。對已知濃度樣本系列稀釋后檢測以獲得靈敏度；檢驗豬、鴨、雞、魚、羊和大腸桿菌DNA進行種屬特異性分析；檢測含有腐殖酸、血紅蛋白、靛藍、鈣離子、EDTA、血紅素等抑制劑的DNA樣本進行耐受能力測試。對實際檢案中的無核檢材(毛干)、降解檢材(骨骼)以及需要進行母系親緣關(guān)系鑒定的檢材(姐妹關(guān)系鑒定)進行檢測,評估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。結(jié)果本研究成功建立了mtDNA SNP 60位點的四色熒光復(fù)合擴增檢測體系,實現(xiàn)了對線粒體SNP位點的高通量檢測。突變型和野生型為相差2-4個堿基的產(chǎn)物峰,其分型結(jié)果與直接測序結(jié)果一致。200例漢族樣本及200例維吾爾族樣本均可得到清晰分型,其中漢族樣本可被歸入72種單倍型,單倍型頻率為0.978,DP值達97.28%；維吾爾族樣本可被歸入61種單倍型,單倍型頻率為0.972,DP值為96.69%。遺傳關(guān)系分析顯示兩個人群有差異,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。靈敏度檢測結(jié)果顯示,FAM及HEX熒光標記的兩組靈敏度較高,可達0.1pg/μL總DNA, TAMRA組為0.5pg/μL總DNA。在0.5-2pg/μL范圍之內(nèi)可得到較好的分型結(jié)果。種屬特異性檢測中,對豬、鴨、雞、魚、羊和大腸桿菌DNA均無特異性擴增產(chǎn)物。耐受能力測試顯示對PCR抑制劑均有一定的耐受力。對實際檢案的檢材能夠進行分型。結(jié)論本研究建立的線粒體SNP位點四色熒光復(fù)合擴增檢測體系,操作簡便,結(jié)果可靠,靈敏度高,與直接測序法、微測序法等相比較,對DNA模板量要求較低,且能夠進行快速篩查。通過自行設(shè)計的引物,將AS-PCR技術(shù)與CE相結(jié)合,能在現(xiàn)有的法醫(yī)STR檢測平臺上,達到高通量、低成本、可重復(fù)檢測線粒體SNP的要求。根據(jù)進化樹以及文獻報導(dǎo)選擇針對中國人群單倍型的位點,在漢族人群以及維吾爾族人群中顯示出較高的多態(tài)性。對毛干、骨骼等能夠進行分型,滿足法庭科學(xué)檢驗中母系親緣關(guān)系檢驗以及高降解疑難檢材的檢測需求。
【關(guān)鍵詞】：線粒體DNA 單核苷酸多態(tài)性 等位基因特異性PCR 單倍型 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：D919
【目錄】：

• 英文縮寫4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 線粒體單核苷酸多態(tài)性AS-PCR復(fù)合檢測體系的建立13-34
• 1 材料與試劑13
• 2 主要實驗方法13-26
• 3 結(jié)果26-29
• 4 討論29-34
• 第二部分 群體調(diào)查與數(shù)據(jù)分析34-41
• 1 材料與試劑34
• 2 主要實驗方法34-35
• 3 結(jié)果35-39
• 4 討論39-41
• 第三部分 可行性評估及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用41-52
• 1 材料與試劑41
• 2 主要實驗方法41-43
• 3 結(jié)果43-51
• 4 討論51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻53-58
• 附錄一 綜述58-73
• 參考文獻67-73
• 附錄二 在讀期間撰寫論文及獲獎情況73-74
• 致謝74-75

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 Allah Rakha;楊麗;李生斌;;單核苷酸多態(tài)性與法醫(yī)學(xué)DNA分型技術(shù)(英文)[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2007年05期

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4 趙亮;劉志瑾;任寶平;李明;;滇金絲猴線粒體D-loop片段SNPs位點的鑒別及初步分析[J];獸類學(xué)報;2010年03期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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2 甘瑞靜;廣西北部平話漢族群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2008年

3 秦書明;廣西南部平話漢族群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2009年

4 何瓊;MtDNA SNPs復(fù)合檢測體系建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：線粒體單核苷酸多態(tài)性AS-PCR復(fù)合檢測體系的建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：342928