發(fā)布時(shí)間：2017-05-03 05:02

  本文關(guān)鍵詞：dTMP活性肽的篩選及其對放射損傷小鼠血小板減少癥的救治作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血小板由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生，不僅具有凝血、止血功能，而且還參與機(jī)體抗感染、血管及組織修復(fù)等重要病理生理過程。骨髓為輻射敏感器官，當(dāng)人員暴露于電離輻射后，骨髓造血干細(xì)胞的增殖與分化活性受到抑制，從而引起體內(nèi)巨核細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少，導(dǎo)致外周血血小板水平低下，易發(fā)生惡性出血、感染甚至危及生命。此外，臨床上原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥也頗為常見，如特發(fā)性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及惡性腫瘤化/放療等也可導(dǎo)致血小板減少癥的發(fā)生。促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化，加速血小板的生成是提高外周血血小板水平、有效救治血小板減少癥的關(guān)鍵所在。然而，目前臨床上針對血小板減少癥的特效藥物和救治手段較為缺乏，并且還存在著毒副反應(yīng)突出、治療費(fèi)用高昂等諸多缺陷。所以，探尋高效促血小板生成藥物并對其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究具有重要意義。 促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),又稱巨核細(xì)胞生長及發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF)，共由332個(gè)氨基酸組成，能夠與巨核細(xì)胞表面相應(yīng)的受體c-Mpl結(jié)合，從而刺激巨核系祖細(xì)胞/巨核細(xì)胞的增殖與成熟分化，并最終促進(jìn)血小板的產(chǎn)生與釋放。TPO是目前已知的巨核細(xì)胞及血小板系統(tǒng)最主要、作用最強(qiáng)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。但是，通過基因工程制備并經(jīng)聚乙二醇修飾的第一代巨核系生長因子類基因工程藥物(rhTPO和rhMGDF)因在臨床試驗(yàn)過程中誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對TPO的中和性抗體，造成自身內(nèi)源性TPO活性受抑，從而導(dǎo)致血小板數(shù)量進(jìn)一步減少。因此，美國食品與藥品管理局(FDA)至今未批準(zhǔn)rhTPO類藥物進(jìn)入臨床。目前國外研究機(jī)構(gòu)已基本停止了對重組人TPO的藥用研發(fā)，轉(zhuǎn)而探尋TPO類似物或其它模擬物。 Cwirla等學(xué)者于1997年運(yùn)用噬菌體表面展示技術(shù)篩選到了一種與天然TPO生物學(xué)特性相似而又與TPO無序列同源性的短肽(僅由14個(gè)氨基酸構(gòu)成)，命名為促血小板生成素模擬肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。研究證實(shí)，TMP與巨核細(xì)胞表面TPO受體(c-Mpl)具有較高的親和能力，，可促進(jìn)依賴TPO細(xì)胞株的增殖和分化，而且由于與天然TPO無相同氨基酸序列，所以不會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TPO中和性抗體。但是，由于其促血小板生成活性相對較弱，且在機(jī)體內(nèi)半衰期較短，導(dǎo)致其推廣應(yīng)用受到極大限制。 研究發(fā)現(xiàn)，TPO之所以具有突出的促巨核細(xì)胞增殖、分化和升血小板活性，是因?yàn)樗軌蛲瑫r(shí)結(jié)合兩個(gè)配對的c-Mpl分子，而也只有當(dāng)c-Mpl分子形成二聚體后才能激活胞內(nèi)有關(guān)增殖、分化的信號通路。由于一個(gè)TMP單體肽只能結(jié)合一個(gè)c-Mpl分子，所以盡管其與c-Mpl分子具有較高的親和力，但是其促巨核細(xì)胞增殖、分化的活性并不突出。如果將兩條TMP單鏈連接形成TMP二聯(lián)體(dTMP)，一個(gè)dTMP多肽則可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)配對的c-Mpl分子，從而顯著提高其促血小板生成活性。 有研究報(bào)道，促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)的模擬肽EMP1與同源肽EMP33均可與受體EPOR結(jié)合，但是EMP33并不能激活EPOR下游的JAK-STAT信號通路，原因在于EMP1和EPOR的復(fù)合體與EMP33和EPOR的復(fù)合體的旋轉(zhuǎn)角度不同(相差約15度)。有研究提示兩個(gè)EMP1之間的連接肽可以調(diào)節(jié)兩個(gè)EMP1的角度，所以選擇合適的連接肽對于提高EMP1二聚體的活性至關(guān)重要。同理，兩個(gè)TMP之間連接肽的選擇也會對dTMP與c-Mpl的結(jié)合及其促血小板生成活性產(chǎn)生顯著影響。 因此，為了尋找具有突出升血小板活性的dTMP線性多肽，在本研究中我們首先設(shè)計(jì)并合成了一系列由不同連接肽將兩個(gè)TMP頭尾串聯(lián)起來的dTMP多肽，從長度及氨基酸組成兩個(gè)層面對連接肽進(jìn)行篩選。然后，從激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路的角度探討dTMP優(yōu)選肽促巨核細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)制，同時(shí)，結(jié)合分子動力學(xué)模擬及分子對接軟件對dTMP的三維結(jié)構(gòu)及其與受體c-Mpl的結(jié)合方式進(jìn)行分析。最后，復(fù)制急性放射損傷小鼠血小板減少癥實(shí)驗(yàn)動物模型，觀察dTMP優(yōu)選肽對放射損傷所致小鼠血小板減少的救治作用。所獲得的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下： 1.連接肽長度對dTMP的促巨核細(xì)胞增殖活性具有顯著影響，其中由8個(gè)G(甘氨酸)作為連接肽的dTMP活性較為突出。 2.通過對連接肽的氨基酸組成進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)在連接肽結(jié)構(gòu)中加入脯氨酸(Proline,P)可顯著提升dTMP的促巨核細(xì)胞增殖活性。 3.通過兩輪篩選最終獲得與等摩爾TPO具有相似活性的dTMP優(yōu)選肽(命名為No.341多肽)。 4.小鼠骨髓原代巨核細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，經(jīng)No.341多肽刺激培養(yǎng)14天，小鼠Sca+-I細(xì)胞表面CD41/CD61(巨核細(xì)胞成熟標(biāo)志物)的表達(dá)水平較IL-3對照組顯著增高(83.26±6.26%vs15.70±2.31%, P＜0.01)，進(jìn)一步證實(shí)該TMP二聯(lián)肽具有顯著促巨核細(xì)胞成熟、分化的作用。 5. Western blot結(jié)果顯示，dTMP(No.341多肽)作用10min即可顯著上調(diào)M07e細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT5及ERK1/2的磷酸化水平。另一方面，給予JAK-STAT和ERK信號通路阻斷劑則可以顯著抑制No.341多肽的促巨核細(xì)胞增殖作用，提示dTMP生物活性的發(fā)揮與其能夠快速激活STAT5和ERK1/2信號通路有關(guān)。 6.分子動力學(xué)模擬及分子對接分析結(jié)果表明，連接肽的長度和氨基酸組成可以顯著影響dTMP的空間構(gòu)象，包括兩條TMP單鏈之間的角度、跨度以及活性位點(diǎn)的暴露等，并能決定dTMP與c-Mpl的分子對接方式，在一定程度上揭示了連接肽影響dTMP活性的內(nèi)在機(jī)制。 7.與生理鹽水對照相比，dTMP(No.341多肽)能夠顯著提高急性放射損傷(5GyCo60γ射線照射)小鼠的外周血血小板最低值水平，并能促進(jìn)血小板水平恢復(fù)，證實(shí)dTMP對血小板減少癥具有顯著救治作用。
【關(guān)鍵詞】：TMP 二聯(lián)體多肽 血小板生成 血小板減少 連接肽 放射損傷
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R818.74
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• Abstract7-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 1.1 選題緣由13
• 1.2 研究背景13-14
• 1.3 研究意義14
• 1.4 研究內(nèi)容14-15
• 1.5 研究方法15-16
• 第二章 促巨核細(xì)胞增殖及升血小板活性 dTMP 線性多肽的篩選16-29
• 2.1 材料與方法16-20
• 2.2 結(jié)果20-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結(jié)27-29
• 第三章 dTMP 促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化的機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系研究29-53
• 3.1 材料與方法29-38
• 3.2 結(jié)果38-47
• 3.3 討論47-51
• 3.4 小結(jié)51-53
• 第四章 dTMP 對輻射誘導(dǎo)小鼠血小板減少癥的救治作用研究53-62
• 4.1 材料與方法53-56
• 4.2 結(jié)果56-60
• 4.3 討論60-61
• 4.4 小結(jié)61-62
• 全文總結(jié)62-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 文獻(xiàn)綜述 促分裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)對巨核細(xì)胞增殖分化及血小板生成調(diào)控的研究進(jìn)展69-79
• 參考文獻(xiàn)76-79
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果79-80
• 致謝80

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本文編號：342344