目的探討蛻皮甾酮（Ecdysterone,EDS）對(duì)損傷軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法1.手術(shù)分離SD大鼠膝關(guān)節(jié)股骨下端關(guān)節(jié)面軟骨組織。2.采用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶共同消化法獲取原代細(xì)胞。3.采用形態(tài)學(xué)觀察、甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫熒光染色的方法鑒定細(xì)胞。4.采用細(xì)胞劃傷的方法構(gòu)建損傷軟骨細(xì)胞模型,模擬軟骨損傷的生物學(xué)變化。5.篩選EDS作用于損傷軟骨細(xì)胞的最適藥物濃度,并將該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。6.通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力,研究EDS對(duì)損傷軟骨細(xì)胞增殖的影響。7.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率,研究EDS對(duì)損傷軟骨細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果1.本實(shí)驗(yàn)成功獲取了活性和純度均較高的原代軟骨細(xì)胞。2.EDS干預(yù)損傷軟骨細(xì)胞的最適藥物濃度為3μmol/L。3.與對(duì)照組相比,損傷組細(xì)胞的增殖活力明顯下降（P<0.05）;與損傷組相比,EDS干預(yù)組細(xì)胞的增殖活力明顯升高（P<0.05）;EDS干預(yù)組和對(duì)照組相比,細(xì)胞的增殖活力無(wú)顯著性差異（P>0.05）。4.與對(duì)照組相比,損傷組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P<0.05）;與損傷組相比,... 

【文章來(lái)源】：河南師范大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖

3.5 實(shí)驗(yàn)方法由于本課題研究主要是圍繞細(xì)胞實(shí)驗(yàn)展開(kāi)，因而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中尤其是在進(jìn)行單純的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)必須嚴(yán)格要求在無(wú)菌的條件下完成；為更好的確保實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行過(guò)程中的無(wú)菌環(huán)境，實(shí)驗(yàn)時(shí)需要完成以下一些基本的操作：實(shí)驗(yàn)于開(kāi)始前務(wù)必穿戴專(zhuān)用工作服、一次性無(wú)菌乳膠手套和一次性口罩等；超凈工作臺(tái)在使用之前需要打開(kāi)工作臺(tái)內(nèi)的紫外燈進(jìn)行 30min 的紫外照射；超凈工作臺(tái)使用結(jié)束之后清理廢液缸并用無(wú)菌的 75%醫(yī)用酒精全面擦拭超凈工作臺(tái)的臺(tái)面 2 - 3 遍才可以將超凈工作臺(tái)關(guān)閉；進(jìn)入細(xì)胞間后，應(yīng)用 75%醫(yī)用酒精噴壺適量噴灑自己的工作服和手套；每?jī)芍鼙仨殞?duì)細(xì)胞間進(jìn)行一次常規(guī)性的消毒；觀察細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)是否污染，定期更換細(xì)胞培養(yǎng)箱下托盤(pán)里的無(wú)菌超純水，對(duì)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行 90℃高溫滅菌。下圖為本研究實(shí)驗(yàn)環(huán)境及部分滅菌操作（圖 3-2）。

具體操作步驟如下。1) 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌吸管吸取原來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)液，之后向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入 5ml 無(wú)菌的 PBS 磷酸緩沖液洗滌 3 遍。2) 棄去洗滌液并用加入 500μl 的 0.25%胰蛋白酶溶液，待絕大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)由多角形逐漸變?yōu)榻鼒A形且有部分細(xì)胞漸漸處于非貼壁狀態(tài)時(shí)；迅速向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3-5 ml 新鮮的低糖 DMEM 完全培養(yǎng)液，用以終止細(xì)胞的消化，完成后用移液槍輕輕反復(fù)的吹打培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞混合液，直至混合液基本形成單細(xì)胞懸液的狀態(tài)。3) 將得到的單細(xì)胞懸液按照體積為 1:2 或 1:3 的比例將其傳代至新的 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并且用低糖 DMEM 完全培養(yǎng)液將每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的液體補(bǔ)充至 5ml 左右；于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)（原培養(yǎng)瓶可繼續(xù)使用，但使用時(shí)間不宜超過(guò)一個(gè)月）。綜上可知，細(xì)胞達(dá)到一定融合程度（圖 3-3A）時(shí)需要進(jìn)行消化處理；細(xì)胞在消化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)從瓶底逐漸脫落并在懸浮液中游走的現(xiàn)象（圖 3-3B、圖 3-3C）；消化完成后基本所有的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，懸浮的細(xì)胞形態(tài)呈圓形（圖 3-3D）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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