目的:耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）（簡(jiǎn)稱(chēng)DR）是一種對(duì)電離輻射,紫外線(xiàn),強(qiáng)氧化劑和化學(xué)誘變劑具有超強(qiáng)耐受力的極端微生物,是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的抗輻射能力最強(qiáng)的生物之一。最近研究表明,負(fù)責(zé)這一抗性的開(kāi)關(guān)基因—pprI基因在DNA損傷修復(fù)中起著極為重要的作用。pprI基因可作為一個(gè)保護(hù)開(kāi)關(guān)基因誘導(dǎo)DNA修復(fù)基因如recA和pprA的表達(dá),在提高細(xì)胞抗氧化能力方面,也可能通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化氫酶的表達(dá)活性來(lái)提高抗H2O2的能力。我們近年的研究表明,pprI基因轉(zhuǎn)染對(duì)哺乳動(dòng)物中子和γ射線(xiàn)急性放射損傷具有顯著的防治作用。然而,基因轉(zhuǎn)染用于放射損傷的防治存在一定的困難和局限性。因此,本課題進(jìn)一步研究pprI基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、PprI蛋白的表達(dá)及其純化,并將其注入受照小鼠體內(nèi),研究PprI蛋白對(duì)小鼠γ射線(xiàn)急性放射損傷的防治作用。耐輻射球菌pprI基因表達(dá)的PprI原核蛋白對(duì)真核生物的抗放作用,迄今尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。材料與方法:以我們已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利的pCMV-HA-pprI質(zhì)粒為模板,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-His-pprI,并轉(zhuǎn)化入E. coli ... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PprI基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖 2. PprI 基因煮菌驗(yàn)證電泳圖注：1~14：煮菌驗(yàn)證產(chǎn)物2.重組原核表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序鑒定選取初步鑒定顯示陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 NCBI 公布的 pprI 基因堿基序列進(jìn)行比對(duì)，顯示二者堿基序列完全一致。三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定圖 3 SDS-PAGE 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，菌體總蛋白在37KD 處有一條新帶，而未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的菌中未發(fā)現(xiàn)此帶。同時(shí)，SDS-PAGE 結(jié)果顯示不同誘導(dǎo)濃度、溫度和時(shí)間在相對(duì)分子量為 37KD 處見(jiàn)到特異性的 PprI 蛋白條帶具有一定的差異，IPTG2mmol/L 較 1 mmol/L 誘導(dǎo)后目的蛋白條帶增粗，IPTG 誘導(dǎo) 6h 較 4h 后目的蛋白條帶增粗，37℃誘導(dǎo)較 25℃誘導(dǎo)后蛋白條帶增粗。

圖 3 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析（考馬斯亮藍(lán)染色）注：1~3: IPTG2mmol/L，25℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h ；4~6: IPTG1mmol/L，25℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h；7~9: IPTG2mmol/L，37℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h ；10~12: IPTG1mmol/L，37℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h四、純化融合蛋白的 Western blotting 鑒定Western blotting 分析表明，含有 His-PprI 融合蛋白的 2、3、4、6、7 可與 His抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，見(jiàn)圖 4。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗輻射球菌pprI基因活體電轉(zhuǎn)染對(duì)受照小鼠睪丸病理學(xué)作用的研究[J]. 連利霞,陳婷婷,張永芹,王秀珍,楊占山.  輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào). 2011(01)
[2]抗輻射球菌pprI基因活體電轉(zhuǎn)染救治小鼠γ射線(xiàn)損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 陳婷婷,連利霞,牟英,楊占山.  輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào). 2010(03)
[3]細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)及其應(yīng)用前景[J]. 房永祥,馮海燕,莫斯科,景志忠.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2009(09)
[4]包涵體蛋白的分離和色譜法體外復(fù)性純化研究進(jìn)展[J]. 王增,馬會(huì)勤,張文,陳尚武.  中國(guó)生物工程雜志. 2009(07)
[5]人4-1BBL胞外區(qū)/抗CD20融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)[J]. 劉榮,姜文國(guó),劉芳,張硯君,范冬梅,楊銘,熊冬生,楊純正.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2008(06)
[6]抗輻射菌中DNA損傷修復(fù)主要基因群的研究進(jìn)展[J]. 施美星,屠振力.  激光生物學(xué)報(bào). 2007(03)
[7]人NKp44基因克隆及其在大腸埃希菌中的表達(dá)和純化[J]. 高新譜,劉正敏,王來(lái)城,焦玉蓮,劉義慶,張雪,趙躍然.  中華腫瘤防治雜志. 2007(10)
[8]PprI和RecX蛋白對(duì)耐輻射奇球菌抗氧化作用的影響[J]. 田兵,張韶文,許鎮(zhèn)堅(jiān),盛多紅,華躍進(jìn),高冠軍.  微生物學(xué)報(bào). 2006(02)
[9]耐輻射球菌DNA修復(fù)開(kāi)關(guān)基因pprI缺陷性突變和功能補(bǔ)償性突變株的建立[J]. 高冠軍,陸輝明,黃麗芬,華躍進(jìn).  科學(xué)通報(bào). 2005(03)
[10]耐輻射球菌pprI突變株的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J]. 鄭智國(guó),張春潮,華躍進(jìn).  浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2005(01)

博士論文
[1]三組治療艾滋病的靶向融合蛋白的基因工程研究[D]. 楊晶.中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3124918