研究背景刑事偵查中,判定案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)收集的可疑生物斑的組織來(lái)源,為犯罪現(xiàn)場(chǎng)重建、案件事實(shí)查明提供重要線索。近年來(lái)基于mRNA/microRNA的分子生物學(xué)方法被廣泛探索,研究證實(shí)其特異性、靈敏度較傳統(tǒng)鑒定方法高,但穩(wěn)定性容易受空氣中存在的核糖核酸酶影響,因此難以廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐。基于DNA甲基化標(biāo)記的方法具有特異性好、靈敏度和穩(wěn)定性高、不額外消耗生物檢材、和法醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)室DNA分型平臺(tái)相兼容等優(yōu)勢(shì),成為法醫(yī)學(xué)界新的研究熱點(diǎn)。人類基因組中存在大量組織特異性差異甲基化區(qū)域(tDMRs),通過(guò)比對(duì)這些區(qū)域的甲基化狀態(tài)可以鑒定不同的組織類型。近年來(lái)法醫(yī)學(xué)相關(guān)研究報(bào)道了一些體液特異性DNA甲基化標(biāo)記,可有效鑒定生物斑的組織來(lái)源,但依然存在諸多問(wèn)題,如不同研究篩選出的甲基化標(biāo)記不一致以及不同體液間甲基化水平容易出現(xiàn)交叉。因此有必要對(duì)現(xiàn)有研究結(jié)果通過(guò)統(tǒng)一平臺(tái)作驗(yàn)證比較分析,通過(guò)采用準(zhǔn)確可行的甲基化定量方法,篩選出適用于本地人群的更加高效的體液來(lái)源鑒定標(biāo)記,為建立可靠的體液來(lái)源鑒定方法提供一定的參考。方法從相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中選擇五種體液特異性較好的CpG位點(diǎn)作為本次研究的候選標(biāo)記。以人體外周血、精液、唾液、陰道分泌液和月經(jīng)血五種常見(jiàn)法醫(yī)學(xué)體液斑為研究樣本,每種體液斑20例。采用甲基化SNaPshot方法,經(jīng)基因組DNA提取,亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化,PCR擴(kuò)增,單堿基引物延伸,毛細(xì)管電泳分析等步驟,檢測(cè)候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平。最后對(duì)每個(gè)候選CpG位點(diǎn)在不同體液的甲基化特異性和個(gè)體穩(wěn)定性進(jìn)行分析,篩選出甲基化體液特異性強(qiáng)且穩(wěn)定性好的CpG位點(diǎn)。CpG位點(diǎn)甲基化水平計(jì)算公式為:甲基化%=C峰高/(C峰高+T峰高)×100=G峰高/(G峰高+A峰高)×100。結(jié)果本課題篩選出了9個(gè)較為理想的體液特異性DNA甲基化標(biāo)記:精液特異性低甲基化標(biāo)記cg22407458-288d,精液特異性高甲基化標(biāo)記cg05656364-283d;血液特異性高甲基化標(biāo)記cg08792630,血液特異性未甲基化標(biāo)記cg26285698+39d和cg26285698-14d;唾液特異性高甲基化標(biāo)記cg09652652-2d;陰道分泌液特異性高甲基化標(biāo)記cg26079753-7d;月經(jīng)血特異性甲基化標(biāo)記cg09696411和cg09696411+25d。結(jié)論本次研究利用復(fù)合甲基化SNaPshot的方法驗(yàn)證篩選出9個(gè)在本地人群具有更高體液特異性和個(gè)體穩(wěn)定性的DNA甲基化遺傳標(biāo)記,為構(gòu)建更加高效、可靠的體液來(lái)源鑒定方法提供可靠的參考。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：D919
【部分圖文】：

圖 2 五種體液 M1 體系甲基化檢測(cè)電泳圖2.2.2 M2 體系甲基化檢測(cè)電泳圖結(jié)果血液鑒定候選標(biāo)記 BL1 顯示出較高的血液特異性，在血液中高甲基化（甲基化水平 0.9），在其他體液低甲基化（月經(jīng)血，甲基化水平 0.6）甚至完全未甲基化（精液、唾液和陰道分泌液）。唾液鑒定候選標(biāo)記 SA1 顯示出極高的唾液特異性，在唾液中高甲基化（甲基化水平 0.85），其他體液完全未甲基化。

圖 3 五種體液 M2 體系甲基化檢測(cè)電泳圖2.2.3 M3 體系甲基化檢測(cè)圖結(jié)果精液鑒定候選標(biāo)記 SE4 和 SE3 顯示極高的精液特異性：SE4 在精液中完全甲基化，在其他體液完全未甲基化；SE3 在精液中完全未甲基化，在其他體液完全甲基化。血液鑒定候選標(biāo)記 BL3 顯示較高的血液特異性，在血液中完全未甲基化，在其他體液中部分甲基化。血液鑒定候選標(biāo)記 BL5 未顯示血液特異性，幾乎在所有體液中均未甲基化。唾液鑒定候選標(biāo)記 SA3 顯示精液特異性高甲基化，在精液中高甲基化（甲基化水平 0.9），在其他體液低甲基化（血液、唾液、月經(jīng)血，甲基化水平 0.3），甚至未甲基化（陰道分泌液）。陰道分泌液鑒定候選標(biāo)記 VF4顯示出陰道分泌液特異性，雖然在陰道分泌液甲基化水平很低（約 0.1），但在其他體液完全未甲基化。

圖 4 五種體液 M3 體系甲基化檢測(cè)電泳圖2.2.4 M4 體系甲基化檢測(cè)電泳圖結(jié)果血液鑒定候選標(biāo)記 BL6 并未顯示血液特異性，在血液、陰道分泌液和月經(jīng)中均顯示較低甲基化（甲基化水平約 0.2），在精液和唾液中完全未甲基化；血鑒定候選標(biāo)記 BL4 顯示出較好的血液特異性，在血液中完全未甲基化，在其他液顯示部分甲基化（陰道分泌液、月經(jīng)血），甚至完全甲基化（精液、唾液）陰道分泌液鑒定候選標(biāo)記 VF3 顯示精液特異性未甲基化，在其他體液中低甲基（甲基化水平 0.2）。唾液鑒定候選標(biāo)記 SA2 顯示較高的唾液特異性，在唾液高甲基化（甲基化水平 0.7），其他體液完全未甲基化。月經(jīng)血鑒定候選標(biāo)記 和 MB2 顯示極高的月經(jīng)血特異性，在月經(jīng)血中高甲基化（甲基化水平約 0.25）其他體液完全未甲基化。

【參考文獻(xiàn)】

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1 李永增;謝樹(shù)森;陳榮;;人體組織拉曼光譜檢測(cè)與技術(shù)進(jìn)展[J];中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志;2011年03期

本文編號(hào)：2814307