【摘要】：目的和意義:隨著微波技術的普及,其在生活、生產以及軍事中得到廣泛的應用。中樞神經系統被公認為是微波輻射的敏感靶部位之一,流行病學和實驗研究均表明,微波輻射可導致腦電異常、睡眠障礙以及認知功能的減退。海馬是學習記憶的重要部位,突觸可塑性是學習記憶的神經基礎,樹突棘是構成絕大多數興奮性突觸突觸后成分的結構。SNK-SPAR途徑在由神經元活化并誘導的突觸重構中發(fā)揮關鍵作用。當神經元受到刺激被活化后,SNK與SPAR被磷酸化并發(fā)生相互作用,進而發(fā)生泛素化,并通過蛋白酶體途徑降解,導致PSD-95等突觸后腳手架蛋白丟失,最終使樹突棘從成熟的鈍圓形變成狹長型。已有研究表明,微波輻射可致樹突棘可塑性異常,然而其機制鮮有報道,因此,本研究選擇以SNK-SPAR途徑為切入點,旨在探討微波輻射導致樹突棘可塑性異常的機制,并為微波輻射所導致的腦損傷的防護和治療提供新的候選靶點。材料和方法:(1)采用參數為頻率2.856 GHz,平均功率密度30 mW/cm~2的微波照射Wistar大鼠,對照組與照射組各50只,照射共持續(xù)6周,每次6 min,每周3次。采用Morris水迷宮對實驗大鼠進行空間學習記憶能力檢測,于微波照射后1~5 d進行定位航行實驗,于照射后14 d進行空間探索實驗;于輻射后6 h、7 d、14 d和28 d,采用高爾基染色法對海馬組織神經元樹突棘形態(tài)和分布進行檢測;采用透射電鏡對海馬組織神經元及樹突棘的超微結構改變進行觀察;(2)采用Real time rt-PCR檢測大鼠海馬組織SNK mRNA表達水平的改變;采用Western-blot檢測大鼠海馬組織SNK、SPAR及PSD-95的蛋白表達改變;采用免疫熒光雙標記檢測SPAR和PSD-95相互作用程度的變化;(3)采用參數為頻率2.856 GHz,平均功率密度30 mW/cm~2的微波輻射大鼠原代海馬神經元,共照射3次,每次6 min,每次照射之間間隔6 min;于照射后0 h、6 h、1 d、2 d和3 d,采用CM-DiI染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察輻射后神經元樹突棘分布和形態(tài)的改變;采用HPLC檢測氨基酸遞質釋放情況;采用Real time rt-PCR檢測大鼠原代海馬神經元SNK mRNA水平的改變;采用Western-blot檢測大鼠原代海馬神經元SNK-SPAR途徑主要分子:SNK、SPAR及PSD-95的蛋白表達改變,SNK-SPAR途徑上游分子CaN、CREB、p-CREB和NFATC4、p-NFATC4的表達改變,SNK下游Ras/Rap家族蛋白RasGRF1、RapGEF2和SynGAP表達的變化;采用免疫熒光雙標記檢測p-CREB在神經元內的定位和表達改變;采用免疫共沉淀及NanoLC MS/MS技術檢測照射后SNK和SPAR的磷酸化及泛素化水平的改變;(4)針對以上環(huán)節(jié)給予SNK抑制劑BI2536,檢測SNK及其下游蛋白表達的改變;給予CaN抑制劑FK506,檢測SNK mRNA水平、蛋白表達及其轉錄因子p-CREB表達改變,并同時檢測上述干預后神經元樹突棘分布及形態(tài)的改變。實驗結果:(1)微波輻射對大鼠空間學習記憶能力、海馬組織樹突棘分布以及神經元和樹突棘超微結構的影響。(1)學習和記憶能力:在定位航行實驗中,照射組大鼠平均逃避潛伏期顯著長于對照組(p0.05或p0.01);空間探索實驗中,照射組大鼠在目標象限所用時間百分比和穿越平臺次數的平均值均顯著低于對照組(p0.05);(2)海馬組織神經元樹突棘分布及形態(tài):大鼠海馬組織齒狀回區(qū)顆粒細胞樹突棘密度在照射后6 h、14 d和28 d顯著低于對照組(p0.05),錐體細胞內蘑菇型樹突棘所占百分比在照射后28 d顯著低于對照組(p0.05);(3)大鼠海馬組織神經元/樹突棘超微結構:照射組可見神經元內質網擴張,線粒體腫脹空化,樹突棘微刺內吞,突觸后致密物長度及厚度相比對照組顯著降低(p0.05或p0.01);(2)微波輻射對大鼠海馬組織SNK-SPAR途徑相關分子的影響。(1)微波輻射后SNK mRNA水平在各檢測時間點均顯著上調(p0.01);(2)SNK蛋白表達在照射后6 h降低(p0.01),14 d和28 d時升高(p0.05或p0.01),SPAR蛋白表達在照射后6 h和14 d顯著下調(p0.01),PSD-95在照射后28 d顯著降低(p0.05);(3)SPAR與PSD-95相互作用程度在照射后6 h和28 d時顯著降低(p0.05或p0.01);(3)微波輻射對大鼠原代海馬神經元樹突棘分布以及SNK-SPAR途徑及其上下游分子的影響。(1)微波照射后1d,大鼠原代海馬神經元樹突棘密度和成熟樹突棘百分比均顯著低于對照組(p0.05),照后3 d時恢復;谷氨酸遞質在照射后6 h和3 d顯著低于對照組(p0.01),甘氨酸除照射后6 h外其余各時間點均顯著高于對照組(p0.05或p0.01);(2)大鼠原代海馬神經元內SNK mRNA在照射后即刻顯著降低,在6 h和1 d時顯著升高(p0.05);SNK蛋白表達在照射后即刻下降,照射后6 h和1 d升高(p0.05或p0.01);SPAR在照射后0 h~1 d時顯著降低(p0.05或p0.01),PSD-95在照射后6 h~1 d顯著低于對照組(p0.05或p0.01);(3)SPAR與PSD-95發(fā)生特異性結合的GKBD結構域磷酸化位點由照射前的ser-1567和ser-1472轉變?yōu)檎丈浜蟮膕er-1603;與SNK和SPAR發(fā)生相互作用的泛素蛋白B在照射后均發(fā)生不同程度的升高;發(fā)現微波輻射可引起SPAR與MAP2的相互作用;(4)SNK下游Ras/Rap家族蛋白:微波輻射后0 h~1d,RapGEF2和SynGAP蛋白表達均顯著降低,RasGRF1僅在照射后0 h~6 h時顯著降低(p0.05或p0.01);(5)SNK上游分子:CaN在照射后0 h~3 d表達均顯著降低(p0.05或p0.01),p-CREB在核內高表達并在照射后1 d顯著升高(p0.01),p-CREB在微波照射后1 d向神經元核內轉位,且較對照組相比表達升高(p0.05),p-NFATC4表達在核內表達量極少,且漿蛋白內p-NFATC4在微波照射前后無顯著差異;(4)微波輻射后大鼠原代海馬神經元SNK-SPAR途徑干預實驗。(1)在給予SNK抑制劑BI2536后,照射+BI2536組SNK蛋白表達較對照組及單純照射組顯著降低(p0.05或p0.01),照射+抑制劑組樹突棘密度顯著高于對照組及單純照射組(p0.05或p0.01),成熟樹突棘所占百分比顯著高于單純照射組(p0.05),與對照組相比無顯著差異;(2)在給予CaN抑制劑FK506后,照射+FK506組CaN蛋白表達較單純照射組顯著降低(p0.01)和p-CREB蛋白表達較單純照射組顯著升高(p0.05),SNK mRNA水平顯著高于單純照射組(p0.05),而其蛋白表達與單純照射組相比無顯著差異。結論:30 mW/cm~2微波輻射后:1.大鼠空間學習記憶能力降低;海馬神經元樹突棘分布發(fā)生改變,表現為樹突棘微刺內吞,突觸后致密物厚度和長度減少,齒狀回顆粒細胞樹突棘密度減少,CA區(qū)錐體細胞成熟樹突棘比例降低。2.SNK-SPAR途徑相關蛋白表達異常,SNK上調促使SPAR的降解和PSD-95丟失,使樹突棘成熟受阻,突觸連接弱化,大鼠學習記憶能力下降。3.大鼠原代海馬神經元樹突棘密度和成熟樹突棘所占百分比減少;興奮性氨基酸遞質釋放減少。4.大鼠原代海馬神經元SNK-SPAR途徑穩(wěn)態(tài)破壞:CaN的低表達引起SNK轉錄因子p-CREB表達升高和核轉位,SNK mRNA水平顯著上調,SNK蛋白表達升高,SNK和SPAR磷酸化、泛素化水平升高,SNK下游Ras/Rap家族蛋白表達失衡;5.SNK是微波輻射致樹突棘可塑性異常的有效作用靶點;6.發(fā)現SPAR磷酸化位點改變可能是影響其與PSD-95作用的具體方式;MAP2與SPAR發(fā)生相互作用,為微波輻射致樹突棘可塑性異常的機制研究提供新思路。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R818
【圖文】：

差異性激活并導致神經元凋亡和壞死可能是微波輻射致認知功能障礙的重要機制[12]。然而，對于微波輻射致樹突棘可塑性異常的機制研究目前尚鮮有報道。SNK-SPAR、Ephrin (Eph family receptor interating protein)/Eph、Neuregulin(NRG)/ErbB以及Wnt信號通路等均在調控樹突棘可塑性過程中發(fā)揮重要作用。Eph可啟動新的突觸連接，對處于初期的突觸起到恢復和穩(wěn)定谷氨酸受體的作用還可以調節(jié)樹突棘的形態(tài)；又有研究表明，Ephrins的激活可誘導突觸的形成和形態(tài)變化，然而在成熟的神經系統中Ephrin可調節(jié)突觸功能和長時程增強。Neuregulin/ErbB與精神分裂有關（表現為樹突棘數量減少），NRG1可增加皮層內錐體細胞樹突棘數大小及密度，將ErbB4基因敲除后NRG1對樹突棘大小的作用受到抑制，但對其密度的作用未受影響。Wnt在調節(jié)成人神經系統的功能和結構和中樞神經系統發(fā)育過程中起到關鍵作用，可控制神經干細胞分化，樹突發(fā)育，神經元可塑性以及軸突分枝[13-16]。血清誘導激酶( serum inducible kinase，SNK)與 樹 突 棘 相 關 的 Rap- 特 異 性 GTPase- 活 化 蛋 白 (spine-associated Rapguanosinetriphosphatase activating protein，SPAR) 所構成的SNK-SPAR通路在神經元活化后誘導的突觸重構中起到關鍵作用。

圖 2 樹突棘內 SNK-SPAR 途徑示意圖（Wu LX, et al. Brain Res. 2007）鈣調磷酸酶(Calcineurin, CaN)，又稱鈣神經素，可對SNK的基因轉錄進行調節(jié)（圖2）。CaN是一種可逆性去磷酸化的關鍵酶，鈣離子內流后，它可能通過

樹突棘密度以 10 μm 為單位進行拍攝及分析。采用 Image J 軟件分析神經元高爾基染色結果mageJ 是一個基于 Java 的公共的圖像處理軟件，它能編輯、顯示、分析、保存和打印 8 位，16 位和 32 位的圖片，支持 TIFF，PNG，GIF，JPEG，DICOM，FITS 等多種格式。1）首先，使用 Photoshop 打開一張拍攝好的高爾基組織切片照片；2）依次點擊工具欄上的圖像→調整→黑白，調整黃色使之被“過濾”；3）依次點擊工具欄上的圖像→調整→曲線，拖動曲線至適當的位置，將調節(jié)到適合分析的狀態(tài)，另存圖片；4）用 Image J 軟件打開圖片，首先設置標尺：在圖片上畫一條與標尺等長，依次點擊工具欄上的 Analyze→Set Scale→Known Distance（填上數值）it of length（μm）→勾選 Global→OK；5）依次點擊工具欄上的 Plugins→Analyze→Cell Counter（圖 1-2）；

【參考文獻】

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1 喬思默;胡向軍;王麗峰;彭瑞云;高亞兵;王水明;趙黎;徐新萍;董霽;常公民;蘇鎮(zhèn)濤;;微波輻射對大鼠海馬結構和功能的影響及突觸素Ⅰ在其中的作用[J];軍事醫(yī)學;2013年02期

2 左紅艷;王德文;彭瑞云;王水明;高亞兵;徐新萍;馬俊杰;;電磁輻射對大鼠海馬Raf/MEK/ERK信號通路的影響[J];中國應用生理學雜志;2009年02期

3 ;Effects of GSM 1800 MHz on dendritic development of cultured hippocampal neurons[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年12期

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1 喬思默;磷酸化突觸素Ⅰ及其相關激酶在微波輻射致氨基酸遞質釋放異常中的作用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2014年

本文編號：2768486