【摘要】：背景和目的單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是人類可遺傳變異中最常見的一種,表現(xiàn)為基因組水平上單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列的多態(tài)性,因其具有擴(kuò)增片段小、突變率低、檢測方法靈活以及包含表型和祖先信息等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)引起了法醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家的廣泛關(guān)注。目前通過毛細(xì)管電泳(CE)和新一代測序(NGS)技術(shù),已經(jīng)建立了幾個(gè)基于雙等位基因和三等位基因SNP的法醫(yī)個(gè)體識(shí)別體系。SNP作為一種多態(tài)性遺傳標(biāo)記,在對(duì)血統(tǒng)和表型相關(guān)的特征進(jìn)行分析時(shí)可得到與STR鑒定一致的結(jié)果,特別是在降解檢材中或者微量檢材中相比STR能夠獲取更多的信息,所以我們可以將其應(yīng)用在STR無法完成的個(gè)體識(shí)別中。目前,法醫(yī)學(xué)相關(guān)的SNP主要是通過SNaPshot技術(shù)進(jìn)行基因分型,因?yàn)槠浠蚍中推脚_(tái)ABI 3730-XL測序儀,是法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室中非常普遍的設(shè)備。SNP還可以用于對(duì)復(fù)雜性疾病遺傳因素的研究,通過對(duì)比大量病人與普通人群之間在DNA變異方面的頻率差別,以期發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病中遺傳變異所產(chǎn)生的效應(yīng)。國內(nèi)外對(duì)于復(fù)雜性疾病的遺傳因素的研究主要集中在對(duì)候選基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選上,即通過對(duì)候選基因的分析來研究該位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性,從而確定某些位點(diǎn)是疾病相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(intracranial aneurysm,IA)是由于血管內(nèi)皮層的薄弱導(dǎo)致的顱內(nèi)動(dòng)脈的局限性擴(kuò)張和管壁變薄為特征的獲得性腦血管異常疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì),顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的一般發(fā)病率為3.2%,蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的年發(fā)病率為9/1萬,死亡率高達(dá)50%,占各種類型的腦血管意外事件的比例為5%左右,而發(fā)生蛛網(wǎng)膜下腔出血的原因約有85%是由于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂。流行病學(xué)與遺傳學(xué)研究表明,顱內(nèi)動(dòng)脈瘤由多種遺傳與環(huán)境因素以及它們的相互作用有關(guān),具有群體遺傳異質(zhì)性強(qiáng)、外顯率低、多基因參與等特征,但其遺傳模式尚未確定。對(duì)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的遺傳學(xué)研究的方法主要包括:連鎖分析與候選基因研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究、表達(dá)學(xué)研究以及全外顯子組測序。雖然通過遺傳學(xué)研究已經(jīng)確定了一些與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的易感基因和位點(diǎn),但仍有更多的危險(xiǎn)因素和致病機(jī)制有待發(fā)掘。目前在亞洲人群以及歐洲人群中已經(jīng)進(jìn)行了多項(xiàng)關(guān)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的GWAS研究,并發(fā)現(xiàn)了一些新的潛在的遺傳危險(xiǎn)因子,但是,所得結(jié)論在不同群體間不盡相同,因此,用SNP關(guān)聯(lián)分析查找在我國漢族群體中顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)基因很有必要。本研究所選取的24個(gè)SNP位點(diǎn)位于已經(jīng)報(bào)道的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)基因或可疑相關(guān)基因區(qū)域,調(diào)查這些位點(diǎn)在河南漢族群體和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者群體內(nèi)的遺傳多態(tài)性分布及其差異,查找顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)基因,對(duì)探討顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展新的診療方法和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測可提供幫助,同時(shí),本研究得到的群體遺傳多態(tài)性信息為這些基因座在法醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法1、收集2015年3月至2017年3月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院介入科收治的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者192例,所有患者均經(jīng)臨床檢查(病史、體征、生化檢驗(yàn)、MRA/CTA/DSA)確診。采集192例患者清晨空腹外周血2ml,置于EDTA抗凝管中待用。對(duì)照組為在河南省紅十字血液中心收集到的188例獻(xiàn)血人群的。2、使用萊楓公司2ml血液基因組DNA提取試劑盒提取共380份外周血基因組DNA,并用紫外分光光度計(jì)測量所提取DNA的濃度和純度。3、通過查閱文獻(xiàn)選擇與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的候選基因,在候選基因中挑出MAF較高的SNP位點(diǎn)。隨后,利用SNaPshot方法構(gòu)建熒光標(biāo)記復(fù)合分型體系,通過多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增出包含24個(gè)位點(diǎn)的24個(gè)長度在100—400bp的片段,對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng),最后延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀進(jìn)行基因分型;4、整理所得結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算法醫(yī)學(xué)相關(guān)參數(shù),分析病例組與對(duì)照組之間在DNA變異方面的頻度差別,判斷遺傳變異產(chǎn)生的效應(yīng)。結(jié)果1、檢測24個(gè)SNP位點(diǎn)在河南漢族人群中的基因型頻率分布,χ~2檢驗(yàn)顯示其分布均符合哈迪溫伯格平衡定律。2、在河南漢族人群中,所選24個(gè)SNP位點(diǎn)的累計(jì)個(gè)體識(shí)別率達(dá)0.999998,累計(jì)非父排除概率為0.968814,累計(jì)匹配概率為7.875×10~(-10)。3、rs1072737(χ~2=6.325,Р=0.042)、rs17576(χ~2=6.778,Р=0.034)、rs1800255(χ~2=14.387,Р=0.001)這三個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率在疾病組與對(duì)照組之間的分布差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、rs2275271(OR=1.343,95%CI=1.007~1.791,Р=0.044),rs1800255(OR=1.756,95%CI=1.225~2.516,Р=0.002),這兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率在疾病組與對(duì)照組之間的分布差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,OR1,95%CI1)。結(jié)論1、所選24個(gè)SNP位點(diǎn)在法醫(yī)學(xué)中的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定方面具有應(yīng)用價(jià)值。2、在河南漢族人群中rs17576、rs1800255、rs1072737這三個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性分布與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤存在關(guān)聯(lián)。3、在河南漢族人群中rs2275271位點(diǎn)的T等位基因和rs1800255位點(diǎn)的G等位基因可能是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子,可增加患病風(fēng)險(xiǎn)。
【圖文】：

圖 1 單核苷酸多態(tài)性SNP 標(biāo)記比其它的遺傳標(biāo)記物更能真實(shí)地反映人種、人群及個(gè)體異。我們?nèi)祟惖淖嫦缺徽J(rèn)為誕生在非洲大陸，后來，他們的后代歲月而移居到了世界各地，產(chǎn)生了不同的人種、人群，并形成了，故不同人種之間，，遺傳標(biāo)記的位點(diǎn)及意義都有所不同。全基因人類基因組單體型圖計(jì)劃產(chǎn)生了大量的 SNP 數(shù)據(jù)，基于可被推測類型，可將法醫(yī)學(xué)相關(guān)的 SNP 分為四類：用于個(gè)體識(shí)別的身份信（IISNPs），用于譜系推斷的連鎖信息性遺傳標(biāo)記（LISNPs），體可能的地域或種族來源的祖先信息性遺傳標(biāo)記（AISNPs）以及外部可視化特征的表型信息性遺傳標(biāo)記（PISNPs）[12]。SNP 作為傳標(biāo)記，在對(duì)血統(tǒng)和表型相關(guān)的特征進(jìn)行分析時(shí)可得到與 STR 鑒，有研究認(rèn)為 25-45 個(gè) SNP 位點(diǎn)就可達(dá)到 CODIS 系統(tǒng)的 13 個(gè)的隨即匹配概率，且由于其具有擴(kuò)增片段短、突變率低、分布廣多等特點(diǎn)，法醫(yī)在降解檢材或者微量檢材中能夠獲取更多的信息

圖 2 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的位置和形狀示意圖前，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤遺傳學(xué)因素研究的熱點(diǎn)主要集中在對(duì)于顱內(nèi)動(dòng)脈態(tài)性的研究，關(guān)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的遺傳學(xué)研究的方法主要包括：連基因研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究、表達(dá)學(xué)研究以及全外顯子組測序傳學(xué)研究已經(jīng)確定了一些與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的易感基因和位點(diǎn)，危險(xiǎn)因素和致病機(jī)制有待發(fā)掘。本研究選取了 24 個(gè) SNP 位點(diǎn)的多，其中 18 個(gè)位點(diǎn)的選擇方法是首先選擇出 18 個(gè)文獻(xiàn)中報(bào)道過的易感基因，再通過 NCBI 網(wǎng)站查詢這些基因上所有的 SNP 位點(diǎn)信出最小等位基因頻率（MinimumAllele Frequency，MAF）最高的外 6 個(gè)位點(diǎn)的選擇方法是從文獻(xiàn)中選取與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤密切相關(guān)的研究通過分析基因型和等位基因頻率在動(dòng)脈瘤組與對(duì)照組之間的變異產(chǎn)生的效應(yīng)，對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)相關(guān)研究方面給予為個(gè)體對(duì)環(huán)境、疾病反應(yīng)等差異性基因的數(shù)據(jù)提供參考，并對(duì)于其他人種中的易感基因位點(diǎn)在中國漢族人群中進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：D919

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2700981