【摘要】：在核與輻射事故病人醫(yī)學(xué)救治處理過程中，受照劑量估算最常用的檢測手段仍然是細(xì)胞遺傳學(xué)方法——淋巴細(xì)胞染色體畸變分析。該方法雖然準(zhǔn)確，但操作較繁瑣和費時，在處理大批量傷員時有明顯的局限性。隨著國際反恐與核威脅形勢的需要，建立快速、高通量的生物劑量檢測方法用來快速篩檢批量受照傷員十分必要。應(yīng)用高通量、非侵襲性、快速的代謝組學(xué)技術(shù)尋找生物標(biāo)志物用于評估大量人群受照劑量的研究具有重要的意義。 本研究采用代謝組學(xué)氣相色譜飛行時間質(zhì)譜(GC/TOFMS)技術(shù)匹配主成分分析(PCA)方法，研究不同劑量γ-射線照射大鼠血清中的代謝產(chǎn)物變化，以篩選可用于輻射損傷診斷和劑量估算的生物標(biāo)志物。將SD大鼠分別給予0.75Gy、3Gy和8Gy(劑量率為1.9Gy/min) γ-射線全身照射或者假照射，受照后24小時立即收集血清樣本用于GC/TOFMS分析，多變量數(shù)據(jù)分析采用主成分分析法。結(jié)果表明，大鼠受到不同劑量γ射線照射24小時后，血清中代謝物組成產(chǎn)生了明顯不同的代謝表型，這將有助于建立快速篩查受照人群的模式，以便使受照者盡早接受治療。色譜分析揭示了9種血清代謝物在照后發(fā)生了顯著改變，，上升的代謝物包括肌醇、絲氨酸、賴氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和甘油，下降的代謝物包括異檸檬酸、葡糖酸和硬脂酸。這些差異代謝產(chǎn)物有望成為新的輻射損傷標(biāo)志物，同時可以從這些差異代謝物的角度探索輻射損傷的機制，可能成為放射醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的新視角。 在上述研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，線粒體順烏頭酸酶（MitochondrialAconitase，mACON）具有調(diào)節(jié)異檸檬酸在三羧酸循環(huán)中含量的重要作用，而且mACON在耐輻射細(xì)菌基因組及骨骼肌、心肌等輻射不敏感組織中呈明顯高表達(dá)，在輻射敏感組織中呈低表達(dá)，為此我們設(shè)想照射后mACON的低表達(dá)和活性下降可能會影響電離輻射后細(xì)胞損傷的修復(fù)，也可能是電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因。為了驗證mACON在電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用及分子機制，我們首先構(gòu)建mACON慢病毒干涉和表達(dá)載體，并制備了干涉和表達(dá)mACON慢病毒顆粒。慢病毒干涉顆粒感染HEK293、U937和HeLa三種細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后，建立起熒光穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。與空載細(xì)胞相比，干涉細(xì)胞系HEK293、U937、HeLa細(xì)胞中mACON的mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)為空載細(xì)胞的16%、22%和32%，其mACON的蛋白表達(dá)水平有效減少，成功的構(gòu)建了三種干涉細(xì)胞系。同時，HEK293、U937、HeLa表達(dá)細(xì)胞系中的mACON的mRNA表達(dá)水平與空載細(xì)胞相比，分別上調(diào)至2.8倍、2.0倍和12.0倍。其mACON的蛋白表達(dá)水平明顯增加，表明三種表達(dá)細(xì)胞系成功。 隨后，選用HeLa干涉細(xì)胞系利用流式細(xì)胞方法研究mACON下調(diào)后對電離輻射誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯影響。結(jié)果表明，Hela細(xì)胞經(jīng)2Gy60Coγ射線照射后，隨時間的增加而出現(xiàn)G_2/M期阻滯。HeLa-pSicoR1408細(xì)胞G2/M期比例不僅顯著低于HeLa-pSicoR細(xì)胞（P0.01），而且其G2/M期峰值出現(xiàn)較對照細(xì)胞晚。同時利用U937表達(dá)細(xì)胞系初步研究mACON上調(diào)后對電離輻射損傷后細(xì)胞早期凋亡水平的影響。當(dāng)U937細(xì)胞受到照射后24h，U937-mACON2細(xì)胞的早期凋亡水平與對U937-pBPLV細(xì)胞相比有所下降，而且在10Gy劑量水平上有顯著性差異（P0.05）。這些結(jié)果提示mACON下調(diào)后抑制電離輻射誘發(fā)的G2/M期阻滯，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力降低，提高細(xì)胞輻射敏感性；mACON上調(diào)后，電離輻射誘發(fā)的細(xì)胞早期凋亡比例減少，mACON初步顯示出一定的抗凋亡作用。這些研究為我們從代謝物角度闡述輻射損傷機理及影響輻射敏感性差異的機制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R818

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2397386