【摘要】：目的研究探討真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1,4E-BP1)在電離輻射致細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中尤其是G2/M檢查點(diǎn)和紡錘體結(jié)構(gòu)檢查點(diǎn)的功能調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。方法肝癌Hep G2細(xì)胞模型,經(jīng)60Coγ射線照射誘發(fā)DNA損傷,Western blot檢測(cè)4E-BP1總蛋白和T37/46位點(diǎn)磷酸化蛋白的表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯情況;分子克隆法構(gòu)建敲低4E-BP1表達(dá)的sh RNA干擾質(zhì)粒,采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建4E-BP1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系;細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;磷酸化組蛋白H3/Ser10分子標(biāo)記物免疫標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)M期細(xì)胞及G2/M檢查點(diǎn)功能;使用Nocodazole將對(duì)照細(xì)胞和4E-BP1敲低細(xì)胞同步化于有絲分裂的前中期,隨后去除Nocodazole,細(xì)胞進(jìn)入G1期,來(lái)觀察敲低4E-BP1蛋白表達(dá)對(duì)紡錘體結(jié)構(gòu)檢查點(diǎn)和細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程的影響。結(jié)果Hep G2細(xì)胞在4Gy射線照射后4h、8h,4E-BP1的T37/46位點(diǎn)磷酸化水平升高,4E-BP1總蛋白表達(dá)含量基本不變,同時(shí)細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)顯示4E-BP1磷酸化與細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯過(guò)程相關(guān)聯(lián),高峰是發(fā)生在照射后10~14h。敲低4E-BP1后,細(xì)胞的生長(zhǎng)速度變慢,對(duì)0.5Gy、1Gy較低劑量照射的敏感性增加;4Gy 60Coγ射線照射后兩細(xì)胞系的G2/M檢查點(diǎn)均激活,但G2期阻滯的解除時(shí)間存在差別,照射后12h,轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的He La-shvector細(xì)胞的M期細(xì)胞比例為2.24%而轉(zhuǎn)染敲低4E-BP1蛋白質(zhì)粒的He La-sh4E-BP1細(xì)胞的M期細(xì)胞已上升到4.26%。PI3K激酶抑制劑降低4E-BP1蛋白的穩(wěn)定性。結(jié)論4E-BP1的T37/46位點(diǎn)磷酸化蛋白在60Coγ射線的誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào),敲低4E-BP1蛋白后細(xì)胞生長(zhǎng)活力下降,對(duì)1Gy及以下的低劑量照射的敏感性增加,不影響G2/M檢測(cè)點(diǎn)的激活,但4E-BP1蛋白的低表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞更快的退出電離輻射引起的G2/M期阻滯,4E-BP1蛋白穩(wěn)定性受PI3K激酶家族成員調(diào)控。
[Abstract]:Objective to investigate the function and mechanism of eukaryotic translation initiation factor 4E- binding protein-1 (e IF4E-binding protein 1 + 4E-BP1) in the response to DNA damage induced by ionizing radiation, especially at G 2 / M checkpoint and spindle structure checkpoint. Methods the expression levels of total 4E-BP1 protein and phosphorylated protein at T37 / 46 site were detected by, Western blot in Hep G2 cell model induced by 60Co 緯 -ray irradiation, cell cycle arrest was detected by flow cytometry, and the expression of 4E-BP1 total protein and phosphorylated protein at T37 / 46 site were detected by flow cytometry. The sh RNA interference plasmid with low 4E-BP1 expression was constructed by molecular cloning, the cell line of 4E-BP1 stable knockout was constructed by lentivirus expression system-liposome transfection, the cell growth curve was drawn by cell count method. The phosphorylated histone H3/Ser10 molecular marker was used to detect the function of M phase cells and G 2 / M checkpoint by flow cytometry. Nocodazole was used to synchronize control cells and 4E-BP1 knockout cells in the first and middle stages of mitosis and then remove Nocodazole, cells into G1 phase to observe the effect of low 4E-BP1 protein expression on spindle structural checkpoint and cell mitosis process. Results the phosphorylation level at T37 / 46 of 4E-BP1 was increased in Hep G2 cells at 4 h after 4Gy irradiation, and the expression of total 4E-BP1 protein was almost unchanged. At the same time, cell cycle monitoring showed that 4E-BP1 phosphorylation was associated with G _ 2 / M phase arrest, and the peak occurred at 10 ~ 14 h after irradiation. When 4E-BP1 was knocked down, the growth rate of the cells became slower, and the sensitivity of the cells to 0.5 Gy / 1 Gy irradiation was higher than that of low dose irradiation. The G2 / M checkpoint of the two cell lines was activated after 4Gy 60Co 緯 -irradiation, but the release time of G2 phase arrest was different. The proportion of M-phase cells in He La-shvector cells transfected with control plasmid was 2.24%, while that of He La-sh4E-BP1 cells transfected with low 4E-BP1 protein particles increased to 4E-. Stability of BP1 protein. Conclusion the expression of phosphorylated protein at site T37 / 46 of 4E-BP1 was up-regulated by 60Co 緯 -rays, and the cell growth activity decreased after knocking down the 4E-BP1 protein, and the sensitivity to low dose irradiation of 1Gy and below was increased, and the activation of G _ 2 / M detection point was not affected. However, the low expression of 4E-BP1 protein resulted in faster withdrawal of cells from G _ 2 / M phase arrest induced by ionizing radiation, and the stability of 4E-BP1 protein was regulated by members of PI3K kinase family.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R818

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本文編號(hào)：2345748