本文關鍵詞：干細胞技術在運動醫(yī)學研究中的應用進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院》 2011年

表皮干細胞多向分化潛能特征的發(fā)現(xiàn)及其相關研究

李美蓉  

【摘要】：目的：1.探討表皮干細胞(epidermal stem cells, ESCs)潛在亞群及分析其解剖分布特點；2.試圖建立ESCs轉分化誘導方法,拓展ESCs多向分化潛能；3.明確ESCs體外培養(yǎng)表達譜特征,初步建立ESCs非轉基因重編程為誘導的多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)實驗體系。 方法：1.應用免疫組織化學的方法檢測不同解剖部位皮膚組織CD34的表達。利用RT-PCR技術及免疫熒光染色技術,從mRNA及蛋白水平檢測包皮來源表皮基底層細胞CD34分子表達情況,并從蛋白水平研究ESC特異性標記β1整合素,p63與CD34雙標記的情況。將標本按照年齡分組,應用流氏比較不同年齡組CD34各表位表達的統(tǒng)計學差異。2.采用經(jīng)典方法富集包皮來源未分化角質細胞(undifferentiatied keratinocytes, UKs),通過流氏及免疫熒光方法檢測UKs特異性標記,評價Epilife培養(yǎng)體系對UKs的生長增殖作用,并通過檢測fibroenctin, nestin, c-kit排除可能的其他種類細胞的污染,保證UKs純度。UKs生長到密度為80%-95%時做為誘導初始細胞,分別采用直接血清誘導法、直接定向誘導培養(yǎng)基誘導法和馴化誘導法進行誘導。檢測成脂相關mRNA及油紅O染色證實脂肪系列轉分化,檢測成肌相關mRNA及SMA免疫熒光染色證實肌肉系列轉分化,檢測成神經(jīng)相關mRNA水平及nestin,β3-tubulin, GFAP免疫熒光染色證實神經(jīng)系列轉分化。血清誘導包皮來源皮膚組織全層碎塊,模擬創(chuàng)傷局部血清滲出條件,免疫熒光檢測角質細胞的細胞類型轉變。建立小鼠損傷模型,選取不同時間點利用免疫熒光技術檢測創(chuàng)傷局部角質細胞細胞類型轉變。3mRNA水平檢測體外培養(yǎng)ESCs表達譜的動態(tài)變化特征(特別是多潛能轉錄調控關鍵性調控分子)。通過轉染OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc轉基因手段重編程ESCs,或是體外通過胚胎干細胞培養(yǎng)環(huán)境直接誘導ESCs去分化,均通過堿性磷酸酶染色及免疫熒光方法檢測多潛能轉錄分子OCT4, SSEA1, NANOG驗證iPSCs的產(chǎn)生,將獲得iPSCs樣克隆進行擬胚體實驗,以證實誘導的iPSCs的多能性。 結果：1.我們研究發(fā)現(xiàn),CD34分子三種表位在人的頭皮及包皮有所表達,但是在軀干皮中未檢測到。這體現(xiàn)CD34分子在不同解剖部位的非均衡性分布。CD34陽性細胞多位于表皮突底部,這是ESCs的居所。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)包皮分離表皮基底層細胞中β1整合素及p63陽性細胞要多于CD34表達陽性細胞,并且CD34表達陽性細胞同時表達β1整合素和p63。β1整合素,p63及CD34陽性細胞均隨傳代,陽性表達率呈現(xiàn)下降趨勢。體外培養(yǎng)第6代時,CD34陽性細胞完全消失,只存在少量的β1整合素和p63陽性細胞。另外。我們發(fā)現(xiàn)CD34陽性細胞并不隨著供體年齡的增加出現(xiàn)顯著性變化。2.應用體外細胞馴化誘導策略,能夠實現(xiàn)UKs多向分化。包皮來源UKs在Eplife培養(yǎng)體系中處于高增殖、不分化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),UKs直接置于血清或是定向分化培養(yǎng)基中,UKs只是定向分化為表皮細胞。然而,血清按照一定的比例逐漸增量加入到Eplife培養(yǎng)體系中,即血清馴化誘導,可以在3周之內(nèi)將UKs非定向轉分化為平滑肌細胞、肌成纖維母細胞及少量的脂肪細胞及神經(jīng)細胞。相比之下,系列定向分化培養(yǎng)基與Eplife的聯(lián)合馴化誘導方案,能夠將UKs定向分化為神經(jīng)細胞、脂肪細胞或是肌肉細胞。血清漂養(yǎng)包皮組織48小時(hrs),包皮表皮角質細胞轉分化為vimentin, FSP陽性細胞。單純包皮表皮漂養(yǎng)48hrs,表皮基底層細胞能夠轉分化為SMA陽性細胞。小鼠體內(nèi)模型動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷修復過程中創(chuàng)緣角質細胞能夠轉分化為vimentin, FSP陽性細胞,但是始終未見SMA陽性細胞出現(xiàn)。3.體外培養(yǎng)的ESCs確實存在多潛能轉錄分子OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc, NANOG的滲漏表達,這些分子一致性的在3-5天(d)時達到高峰,這與iPSC產(chǎn)生理論之一——轉錄噪聲的理論相一致。流氏檢測結果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)3d的ESCs中確實存在OCT4表達陽性細胞,這進一步證實了iPSC產(chǎn)生原理的另外一個理論——精英細胞學說。選用體外培養(yǎng)3-5d的ESCs進行轉基因及非轉基因重編程,進入胚胎干細胞培養(yǎng)環(huán)境持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),轉基因重編程在體外誘導6d時,出現(xiàn)iPSCs樣克隆,非轉基因重編程在體外誘導14d時,能夠觀察到iPSC樣克隆,免疫熒光結果顯示這些克隆表達多潛能轉錄分子OCT4, SSEA1, NANOG,同時表達ESCs特異性標記CD29。堿性磷酸酶染色對2種方法重編程的效率進行比較,轉基因明顯高于非轉基因。轉基因為0.3％,非轉基因為0.00002-0.00015%。另外,體外iPSCs樣克隆能夠形成擬胚體,提示其具有發(fā)育能力。 結論：1.在本研究中,我們首次系統(tǒng)性的研究CD34三種表位在不同解剖部位的表達情況,初步顯示CD34可能在頭皮及包皮組織中代表了ESCs的一個亞群,并且CD34在不同解剖部位存在不均衡性進一步證實了干細胞異質性的特征。2.本部分研究數(shù)據(jù)顯示人的UKs在體外具有多向分化能力。另外,通過小鼠的創(chuàng)傷模型也證實在創(chuàng)傷修復過程中存在角質細胞向間質細胞轉變,這些結果提示細胞所處局部微環(huán)境是細胞能夠轉分化,甚至展現(xiàn)多能性的關鍵。同時,本部分研究也是UKs應用于再生醫(yī)學的理論基礎。3.體外培養(yǎng)ESCs的表達譜特征符合iPSC產(chǎn)生的2個基本原理。我們通過轉基因及非轉基因的方式均獲得iPSCs樣克隆。通過初步鑒定結果顯示ESCs可能成為非轉基因重編程產(chǎn)生iPSCs的首選起始細胞。也是消除iPSCs致瘤性風險,并將其應用于臨床的解決辦法之一

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329
【目錄】：

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