本文選題：淋巴毒素α　切入點：核輻射　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：一、研究背景和目的美國Genentech公司早在1996年就發(fā)現(xiàn)野生型淋巴毒素α(Lymphotoxinα,LTα)對核輻射造成的小鼠骨髓損傷具有保護作用,但由于在隨后的臨床前動物試驗中發(fā)現(xiàn)野生型LTα可以引起明顯的不良反應,如嚴重的毛細血管滲漏、低血壓和寒戰(zhàn)發(fā)熱等,從而使LTα的應用研究未能深入進行。本課題組在野生型LTα的基礎上,最初從降低野生型LTα的毒副作用的角度出發(fā),開發(fā)N端缺失27個氨基酸殘基的LTα衍生物(LTα-27)用于聯(lián)合化療。臨床前動物試驗表明,LTα-27聯(lián)合化療藥物能夠發(fā)揮明顯的協(xié)同殺傷上皮來源腫瘤的作用,而不會誘導骨髓來源細胞凋亡的發(fā)生,反而會保護骨髓來源細胞對抗化療藥物的細胞毒作用。但LTα-27在臨床I期階段仍有70%的受試者出現(xiàn)比較嚴重的寒戰(zhàn)發(fā)熱,限制了它的進一步開發(fā),然而令人意外的發(fā)現(xiàn)是臨床I期聯(lián)合使用LTα-27的化療病人,其血小板、淋巴細胞和中性粒細胞下降幅度明顯低于單獨使用化療藥物的患者,即LTα-27顯現(xiàn)出明顯的骨髓/造血細胞保護作用。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)LTα通過與腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)和TNFR2結(jié)合,啟動下游信號通路發(fā)揮其生物學作用,其中毒副作用主要與TNFR2結(jié)合有關(guān)。因此在此研究基礎上,通過計算機輔助設計和實驗篩選,得到與TNFR1特異性結(jié)合,但親和力適中的淋巴毒素衍生物LTα-55。初步的藥效學結(jié)果顯示:LTα-55在獼猴上能夠使血小板和淋巴細胞上升,對抗化療藥物的骨髓損傷作用,在小鼠上能夠?qū)购溯椛涔撬钃p傷使生存率顯著增加。由于環(huán)境污染、能源緊缺,核能作為一種高效清潔的能源,在全球被廣泛運用。但是,核泄露導致的安全隱患卻對人類的生存產(chǎn)生巨大的影響。輻射后病人死亡的主要原因是由于骨髓抑制導致的造血功能障礙以及外周血白細胞下降,繼而使免疫功能損傷,導致繼發(fā)性感染。因此,保護和恢復骨髓功能是關(guān)系到輻射損傷患者預后的關(guān)鍵因素之一,但目前對核輻射導致的骨髓損傷尚缺乏有效的防護手段和治療方法。已有的研究表明輻射導致的損傷主要是輻射使骨髓造血細胞,表皮細胞和粘膜上皮細胞等分裂旺盛的細胞死亡,但最近的研究認為輻射也會導致外周成熟的免疫細胞(如巨噬細胞、T細胞和B細胞等)顯著減少以及促炎因子大量釋放,從而造成損傷細胞修復功能受損,免疫功能抑制。其中,巨噬細胞在機體固有免疫和適應性免疫中起著關(guān)鍵作用,其可以通過調(diào)節(jié)細胞功能,分泌生長因子和吞噬細胞碎片等方式促進炎癥消退和損傷組織的修復。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)中響應輻射損傷最早的細胞類型。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)LTα-55能夠使輻射后小鼠的生存率顯著上升,骨髓造血功能提前恢復,并且在進一步體外研究中發(fā)現(xiàn),LTα-55能促進人單核細胞株thp-1分泌il-1β增多。il-1β的分泌增多和NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)。我們進一步采用NLRP3炎癥小體相關(guān)基因敲除小鼠(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))和人單核細胞株thp-1探討了NLRP3炎癥小體在LTα-55對核輻射小鼠骨髓損傷的保護作用及其可能的機制。二、研究方法體內(nèi)試驗觀察了LTα-55對野生型、Nlpr~(3)~(~(-/-))、Asc~(~(-/-))和caspase-1~(-/-)小鼠核輻射骨髓損傷的保護作用。輻射前兩天和輻射當天小鼠尾靜脈各注射一次250μg/kgLTα-55,9.5gy劑量輻照5分鐘后觀察小鼠存活情況;9.0gy劑量輻照不同時間后進行血象、骨髓和相關(guān)病理(主要臟器)檢查。體外實驗:在人單核細胞株thp-1細胞中觀察LTα-55對核輻射后細胞的增殖、凋亡、焦亡和ros生成的影響。細胞計數(shù)檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測細胞周期的改變、檢測細胞凋亡、細胞焦亡以及ros的生成。電鏡下觀察thp-1細胞中NLRP3炎癥小體的激活,reaLTime-pcr檢測mrna的表達,westernblot檢測蛋白的表達,免疫熒光法檢測骨髓和脾臟組織中的相關(guān)信號通路分子的定位和表達。三、研究結(jié)果(一)LTα-55在在體內(nèi)能促進野生型C57BL/6小鼠核輻射導致的損傷的恢復1、LTα-55能促進野生型C57BL/6小鼠在9.5gy核輻射后生存率的增加,對照組小鼠從d8天開始出現(xiàn)死亡,死亡集中發(fā)生在d8~d9天,至d12天對照組小鼠全部死亡。LTα-55組小鼠,雌性小鼠在d14死亡兩只,雄性小鼠d18死亡一只,其余小鼠均存活至觀察期結(jié)束(d28天)。對體重的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),雄性小鼠在第10天時對照組體重明顯低于LTα-55組。2、LTα-55對野生型C57BL/6小鼠核輻射后血象的恢復有促進作用,結(jié)果顯示LTα-55對輻射小鼠的紅系、白系以及血小板的恢復都有促進作用。3、骨髓涂片結(jié)果顯示LTα-55作用下,9.0gy輻射后的野生型小鼠從第七天開始恢復至第十八天基本恢復正常。而對照組第十八天仍顯示骨髓有核細胞細胞增生低下。骨髓病理顯示出同樣的結(jié)果。4、脾臟病理顯示LTα-55對野生型C57BL/6小鼠核輻射后脾臟的髓外造血有促進作用。相對于溶媒對照組,LTα-55在輻射后第七天脾臟出現(xiàn)淋巴樣增生,第十天出現(xiàn)明顯的髓外造血。(二)LTα-55體體外對核輻射導致人單核細胞thp-1損損傷的保護作作用1、LTα-55能促進thp-1細胞的增殖并促進輻照下thp-1細胞的存活,在50μg/mlLTα-55的作用下能顯著促進細胞增殖。2、6Gy~(60)Co-γ輻照后thp-1細胞發(fā)生g2期阻滯,50μg/mlLTα-55可以幫助細胞在48小時時完全逆轉(zhuǎn)g2期阻滯,恢復正常細胞周期。3、10Gy~(60)Co-γ輻照后thp-1細胞凋亡不明顯,50μg/mlLTα-55處理細胞48小時后和對照組相比凋亡率有所降低。4、10Gy~(60)Co-γ的輻照后,隨著輻射時間的增加,ros逐漸增加,50μg/ml的LTα-55處理細胞可以降低10Gy~(60)Co-γ的輻照后72h細胞內(nèi)ros的含量。5、LTα-55能降低輻射后細胞的焦亡比率,LTα-55對輻射后的細胞有保護作用。(三)LTα-55的保護作用和NLRP3炎炎癥小體相關(guān)1、LTα-55對thp-1細胞中NLRP3炎癥小體的影響(1)LTα-55能夠增加thp-1細胞中NLRP3、caspase-1、il-1βmrna的表達,高濃度的LTα-55作用24小時,il-18mrna水平也升高,同時也能促進thp-1細胞分泌il-1β。(2)電鏡結(jié)果顯示輻射后LTα-55能夠迅速激活thp-1細胞中NLRP3炎癥小體,同時細胞輻射后細胞的損傷程度明顯輕于溶媒對照組。2、LTα-55對C57BL/6小鼠核輻射損傷的保護作用和NLRP3炎癥小體(NLRP3、asc、caspase-1)相關(guān)(1)LTα-55對NLRP3炎癥小體相關(guān)的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠核輻射后一般情況和生存率的保護作用不明顯,和野生型小鼠相比,基因敲除小鼠生存率顯著降低。(2)LTα-55對NLRP3炎癥小體相關(guān)的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠核輻射血象的恢復有一定的促進作用,但該促進作用要明顯弱于野生型小鼠。(3)骨髓涂片結(jié)果顯示LTα-55作用下,9.0gy輻射后的基因敲除小鼠從第14天才開始有恢復的趨勢。而對照組在觀察終點都未見恢復。骨髓病理顯示出同樣的結(jié)果。骨髓結(jié)果顯示,LTα-55對NLRP3炎癥小體相關(guān)的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠的保護作用遠遠弱于野生型小鼠。(4)脾臟病理顯示LTα-55對基因敲除小鼠核輻射后脾臟的髓外造血有一定的促進作用。LTα-55組小鼠在輻射后第14天出現(xiàn)明顯的髓外造血,時間要遲于野生小鼠,LTα-55對小鼠的保護作用野生型要強于基因敲除小鼠。(四)LTα-55能能在體內(nèi)激活nf-κb和NLRP3炎炎癥小體1、與對照相比,野生C57BL/6小鼠胸骨免疫熒光結(jié)果顯示LTα-55激活了nf-κb的p52亞基,同時使NLRP3的表達明顯增高。在野生型小鼠脾臟組織的免疫熒光檢測也證實LTα-55能上調(diào)il-1β表達,該結(jié)果與細胞水平的研究結(jié)論一致。2、用westernblot檢測核輻射和/或LTα-55處理后野生型小鼠和NLRP3~(-/-)小鼠脾臟中NLRP3炎癥小體效應因子的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠中,LTα-55能增加輻射小鼠脾臟中il-1β和il-18的蛋白表達,LTα-55組小鼠在輻射1天和3天后il-1β和il-18分別開始升高,3~5天為高峰,7天仍然明顯高于對照,而在NLRP3~(-/-)小鼠脾臟中il-1β和il-18表達水平均很低。(五)LTα-55在在核輻射小鼠脾臟中通過上調(diào)BCL-XL抑抑制細胞凋亡亡,促進血小板的生成,從而對機體產(chǎn)生保護作用用westernblot檢測核輻射和/或LTα-55處理后小鼠脾臟BCL-XL的蛋白表達,LTα-55能在第七天開始明顯增加核輻射小鼠脾臟中BCL-XL的表達,維持至18天,在NLRP3~(-/-)小鼠中BCL-XL的表達也有升高,但是沒有野生型小鼠明顯,該結(jié)果也和血象監(jiān)測中的血小板監(jiān)測結(jié)果一致。四、結(jié)論LTα-55對核輻射導致的損傷有顯著的保護作用,該作用與LTα-55激活NLRP3炎癥小體,進而減少ROS的釋放,抑制細胞凋亡和焦亡有關(guān)。LTα-55在體外還能拮抗核輻射的細胞周期阻滯作用,促進細胞增殖。LTα-55激活NF-κB(p52)可能參與了NLRP3炎癥小體的激活。LTα-55還能上調(diào)Bcl-XL的表達,這除了與LTα-55保護輻射所致的細胞凋亡和焦亡有關(guān)外,可能還與血小板的再生,進而機體重新啟動免疫有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R818

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本文編號：1691421