本文關(guān)鍵詞：Tricellulin在鉛暴露誘導(dǎo)血—腦脊液屏障通透性改變中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Tricellulin 鉛 緊密連接蛋白 血-腦脊液屏障 MicroRNA

【摘要】：鉛作為一種生活中廣泛應(yīng)用但具有毒性的重金屬，能夠造成人體多個(gè)系統(tǒng)和器官功能紊亂和損傷，尤其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的損傷最為嚴(yán)重。兒童由于其發(fā)育、代謝的特點(diǎn)，對(duì)鉛的神經(jīng)毒性尤為敏感，能夠嚴(yán)重影響兒童CNS發(fā)育，造成智力下降，認(rèn)知功能異常等。鉛神經(jīng)毒性的作用機(jī)制包括多個(gè)方面，近年來研究提示血腦屏障通透性改變?cè)阢U神經(jīng)毒性中的作用越來越引起人們的重視。 血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、血-腦脊液屏障(blood-cerebrospinal fluidbarrier，BCB)在維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。BCB是血腦屏障的重要組成部分，位于腦室脈絡(luò)叢的血液和腦脊液之間，主要由脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞組成，能控制腦脊液的形成和運(yùn)輸，并限制血液中有害物質(zhì)進(jìn)入大腦。脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞之間形成的緊密連接是BCB的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，能有效的阻止有害物質(zhì)從細(xì)胞間隙中穿過。緊密連接主要由多種緊密連接蛋白組成，包括occludin家族，claudin家族和JAM家族。近年來，三細(xì)胞間緊密連接引起人們的廣泛重視。Tricellulin是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的緊密連接蛋白，由于主要分布在三細(xì)胞間，簡(jiǎn)稱TRIC。TRIC存在于三個(gè)上皮細(xì)胞的交界處，不僅是緊密連接的重要組成部分，而且在功能上與跨膜蛋白o(hù)ccludin能形成互補(bǔ)作用。TRIC的分布廣泛，但是其在脈絡(luò)叢細(xì)胞中的表達(dá)及功能尚未見報(bào)道。 BCB是鉛的重要作用靶點(diǎn)之一，鉛暴露能夠引起增加BCB的通透性，從而導(dǎo)致腦內(nèi)鉛含量增加。鉛暴露改變BCB通透性的具體機(jī)制尚不完全明確，可能與鉛暴露引起脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白claudin-1的表達(dá)下降有關(guān)，而TRIC是否在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變中發(fā)揮作用尚不清楚。 【目的】 觀察TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中的表達(dá)，探究TRIC在BCB中的作用；建立鉛誘導(dǎo)BCB通透性改變的細(xì)胞模型，觀察鉛對(duì)TRIC表達(dá)水平的影響，并探討TRIC在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變中的作用及調(diào)控機(jī)制，從microRNA(miRNA)的角度揭示鉛暴露對(duì)TRIC表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明TRIC在BCB中的功能及其在鉛誘導(dǎo)BCB通透性改變機(jī)制中提供理論依據(jù)�！痉椒ā� 1.采用免疫熒光染色、Western blot和PCR的方法檢測(cè)不同發(fā)育期SD仔鼠的脈絡(luò)叢細(xì)胞和體外培養(yǎng)不同時(shí)間的Z310細(xì)胞中TRIC的表達(dá)及定位情況。 2.利用Z310細(xì)胞建立體外BCB模型，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染后，通過檢測(cè)跨膜內(nèi)皮電阻(Transendothelial electrical resistance, TEER)和熒光葡聚糖(FITC-dextran)通透性檢測(cè)降低TRIC表達(dá)對(duì)屏障通透性的影響。 3.利用Z310細(xì)胞建立鉛暴露誘導(dǎo)體外BCB通透性改變模型，采用免疫熒光染色、Western blot、屏障通透性實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒等方法檢測(cè)TRIC在鉛誘導(dǎo)體外BCB通透性改變中的作用。 4.通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)調(diào)控TRIC的microRNA。采用qRT-PCR等方法檢測(cè)鉛暴露后脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞內(nèi)TRIC相關(guān)microRNA的表達(dá)情況，并采用Westernblot、通透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)microRNA對(duì)TRIC的表達(dá)調(diào)控及對(duì)BCB通透性的影響。 【結(jié)果】 1. TRIC在體內(nèi)、體外脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，并參與BCB的形成 免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞存在表達(dá)，主要在三細(xì)胞連接處分布，并且與occludin有共定位現(xiàn)象。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和永生化大鼠脈絡(luò)叢細(xì)胞Z310中均有表達(dá)，，并且隨著仔鼠的發(fā)育和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TRIC mRNA和蛋白表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì)。TEER和熒光葡聚糖通透性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低TRIC的表達(dá)可引起TEER下降至對(duì)照組的84%（P0.05），葡聚糖通透性增加至對(duì)照組的1.5倍（P0.05），提示TRIC在BCB通透性中發(fā)揮重要作用。 2.鉛暴露能降低TRIC的表達(dá)和分布 通過加入5μM和10μM的醋酸鉛，利用Z310細(xì)胞建立鉛暴露誘導(dǎo)體外BCB通透性改變模型，Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉛暴露72h后能顯著降低TRIC的蛋白表達(dá)（P0.05）；免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉛暴露后TRIC在細(xì)胞間的分布明顯減少（P0.05）。 3.高表達(dá)TRIC能抑制鉛暴露引起的體外BCB的損傷 TEER和FITC-dextran通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉛暴露能引起體外BCB的通透性增加；轉(zhuǎn)染高表達(dá)TRIC質(zhì)粒后可增加TRIC的蛋白表達(dá)水平，并且TRIC在三細(xì)胞間的分布也明顯增加；高表達(dá)TRIC能部分降低鉛暴露誘導(dǎo)的體外BCB通透性改變程度（P0.05）。 4. miR-203可能通過調(diào)控TRIC蛋白，參與鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-203可能是調(diào)控TRIC的microRNA；qRT-PCR結(jié)果顯示，鉛暴露能引起脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和Z310細(xì)胞中miR-203表達(dá)升高；加入miR-203inhibitor能有效抑制miR-203的表達(dá)（P0.05），并且降低miR-203的表達(dá)能部分抑制鉛誘導(dǎo)的TRIC蛋白表達(dá)下降（P0.05），在一定程度上減輕鉛對(duì)體外BCB的損傷作用。 【結(jié)論】 1.體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞間存在表達(dá)，且其蛋白含量隨發(fā)育不斷增加，提示TRIC參與BCB的緊密連接的形成；降低TRIC能影響B(tài)CB功能的正常發(fā)揮。 2.鉛暴露能引起Z310細(xì)胞中TRIC蛋白表達(dá)下降并引起TRIC在細(xì)胞間分布減少；高表達(dá)TRIC后能夠在一定程度上降低鉛暴露引起的BCB通透性增加，提示TRIC可能在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性增加中發(fā)揮重要作用。 3.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-203可能是調(diào)控TRIC的microRNA；鉛暴露能改變脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中的miR-203的表達(dá)，而抑制miR-203的表達(dá)能有效減少鉛對(duì)TRIC蛋白表達(dá)的影響，并且在一定程度上抑制鉛暴露造成的BCB通透性改變。 綜上所述，我們的研究結(jié)果證實(shí)了TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的表達(dá)和分布，并發(fā)現(xiàn)其在鉛暴露誘導(dǎo)BCB屏障損傷中的作用。本研究將為TRIC在BCB中的功能及其在鉛神經(jīng)毒性機(jī)制中作用提供理論依據(jù)，并為鉛誘導(dǎo)BCB通透性損傷的機(jī)制提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：Tricellulin 鉛 緊密連接蛋白 血-腦脊液屏障 MicroRNA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-30
• 1 鉛的神經(jīng)毒性16-21
• 2 血-腦脊液屏障與神經(jīng)系統(tǒng)疾病21-27
• 3 MircoRNA 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)27-30
• 實(shí)驗(yàn)一 Tricellulin 在脈絡(luò)叢細(xì)胞中的表達(dá)與功能30-51
• 1 材料30-36
• 2 方法36-44
• 3 結(jié)果44-49
• 4 討論49-51
• 實(shí)驗(yàn)二 TRIC 在鉛暴露誘導(dǎo)血-腦脊液屏障通透性改變中的作用51-62
• 1 材料51-52
• 2 方法52-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-62
• 實(shí)驗(yàn)三 microRNA 在鉛誘導(dǎo) TRIC 表達(dá)改變及血-腦脊液屏障損傷中的作用62-72
• 1 材料62
• 2 方法62-66
• 3 結(jié)果66-70
• 4 討論70-72
• 小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果80-81
• 致謝81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張學(xué)偉;郭紀(jì)鋒;艾三喜;胡雅岑;孫啟英;徐倩;呂占云;李凱;董曉麗;沈璐;江泓;潘乾;夏昆;嚴(yán)新翔;唐北沙;;中國漢族帕金森病人microRNA-7變異分析(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年12期

本文編號(hào)：990198