本文關鍵詞：基于2D和3D Caco-2細胞培養(yǎng)研究納米氧化鋅的安全性

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【摘要】：納米氧化鋅是一種應用前景廣泛的多功能無機納米材料,其具有粒徑微小、比表面活性高、化學性質穩(wěn)定等特點,被廣泛應用于化妝品、電子產品、藥物載體、醫(yī)藥和食品包裝材料。隨著人們與納米氧化鋅接觸的日益增多,其對人類健康的潛在毒性影響也引起了高度關注。研究納米材料對細胞毒性的眾多試驗中,二維(2D)單層細胞培養(yǎng)仍然是占主導地位的體外模型。在傳統(tǒng)2D塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞會失去其原有的組織結構,極性以及蛋白質 蛋白質相互作用,而且相比體內模型往往會改變細胞的代謝、表型以及基因表達。當二維細胞培養(yǎng)模型擴展到納米毒理學研究,它的這些限制有可能導致獲得誤導性結果和結論的風險。實際上在體內的所有細胞都生長在一個三維(3D)環(huán)境中,單個細胞的表型和功能是高度依賴于三維組織-細胞外基質(ECM)蛋白和鄰近細胞的復雜相互作用。因此,在一個高度模擬體內生理環(huán)境的體外3D模型中進行納米粒子的毒性研究可以為納米材料的生物安全性評價提供更多理論基礎和參考價值。為了評估不同粒徑的納米氧化鋅在2D和3D培養(yǎng)模型中對人結腸癌上皮(Caco-2)細胞的毒性作用,首先通過透射電鏡和納米粒度儀對納米氧化鋅粒子的形狀、粒徑大小和分布進行表征。在2D和3D培養(yǎng)條件下,利用倒置顯微鏡觀察納米氧化鋅染毒Caco-2細胞對其形態(tài)的影響,采用MTT比色法檢測細胞活性,對細胞內ROS水平,炎癥因子白細胞介素-8(IL-8)和白細胞介素-1β(IL-1β)進行檢測,通過熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染后的2D細胞死亡形態(tài),同時借助流式細胞儀檢測不同的細胞死亡方式。試驗結果如下:(1)三種納米氧化鋅樣品的平均粒徑為24.53±8.54 nm,56.18±9.56 nm,87.26±13.47 nm。(2)納米氧化鋅引起2D細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,而沒有引起3D細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。24 nm納米氧化鋅對2D細胞的毒性最大,56 nm納米氧化鋅略低,87 nm納米氧化鋅則最小。三種納米氧化鋅的3D細胞活力差異沒有顯著性,表明納米氧化鋅的粒徑大小對3D細胞的毒性影響沒有明顯差異。3D細胞活性明顯高于2D細胞,表明納米氧化鋅對2D細胞毒性明顯高于3D細胞。(3)3D細胞相比2D細胞具有更高的基礎ROS水平。2D細胞的ROS水平呈依賴劑量的方式增加,而3D細胞內ROS水平沒有顯著增加。24 nm納米氧化鋅誘導2D細胞氧化應激程度最高,56 nm納米氧化鋅略低,87 nm納米氧化鋅則最低,而粒徑大小對3D細胞內氧化應激程度的影響沒有明顯差異。高濃度納米氧化鋅(≥75μg/mL)染毒12 h后誘導2D細胞氧化應激程度高于3D細胞。相比2D細胞,納米氧化鋅誘導了3D細胞強烈的炎癥反應。3D細胞的炎癥因子表達量呈劑量依賴方式增加,24 nm納米氧化鋅誘導炎癥反應最強烈。24 nm和56 nm納米氧化鋅誘導2D細胞炎癥反應的結果相似,而87 nm納米氧化鋅相對較低。在3D培養(yǎng)條件下,納米氧化鋅誘導的炎癥反應與ROS水平無關。(4)在2D培養(yǎng)條件下濃度為75μg/mL的24 nm納米氧化鋅引起的晚期凋亡細胞和壞死細胞數(shù)量最多。在兩種細胞培養(yǎng)條件下24 nm納米氧化鋅引起Caco-2細胞死亡數(shù)量都以劑量依賴方式增加。3D細胞相比2D細胞對24 nm納米氧化鋅的毒性響應明顯較低。2D培養(yǎng)條件下壞死成為細胞死亡的主要方式,而3D培養(yǎng)條件下細胞凋亡成為主要死亡方式。
【關鍵詞】：納米氧化鋅 Caco-2細胞 三維 細胞毒性 炎癥反應 細胞死亡
【學位授予單位】：中國計量大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114;TB383.1
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 緒論15-26
• 1.1 引言15
• 1.2 納米材料的應用15-17
• 1.2.1 納米技術15-16
• 1.2.2 納米材料產品16
• 1.2.3 納米氧化鋅的應用16-17
• 1.3 納米氧化鋅的毒理學研究進展17-20
• 1.3.1 納米氧化鋅對細胞的影響17-19
• 1.3.2 納米氧化鋅對動物的作用19
• 1.3.3 納米材料在體內和體外細胞模型中的毒性作用比較19-20
• 1.4 納米氧化鋅的毒性作用機制20-22
• 1.4.1 活性氧自由基的產生20-21
• 1.4.2 鋅離子的釋放21-22
• 1.5 三維（3D）細胞培養(yǎng)的研究背景和進展22-25
• 1.5.1 3D細胞培養(yǎng)的研究背景22
• 1.5.2 3D細胞培養(yǎng)的優(yōu)點22-23
• 1.5.3 3D細胞培養(yǎng)模型的建立23-24
• 1.5.4 Caco-23D細胞培養(yǎng)模型的建立24-25
• 1.6 本課題的研究內容及意義25-26
• 2 納米氧化鋅的表征26-31
• 2.1 前言26
• 2.2 材料26-27
• 2.3 方法27
• 2.4 結果27-29
• 2.4.1 納米氧化鋅樣品的粒徑形態(tài)27
• 2.4.2 納米氧化鋅樣品的粒徑分布27-28
• 2.4.3 納米氧化鋅樣品的平均粒徑28-29
• 2.5 討論29-31
• 3 納米氧化鋅對Caco-2細胞的毒性作用31-39
• 3.1 前言31
• 3.2 材料31-32
• 3.2.1 細胞株31
• 3.2.2 主要試劑31-32
• 3.2.3 主要儀器32
• 3.3 方法32-34
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)32-33
• 3.3.2 細胞染毒處理33
• 3.3.3 細胞形態(tài)學觀察33
• 3.3.4 細胞活性檢測33-34
• 3.3.5 數(shù)據處理34
• 3.4 結果34-37
• 3.4.1 細胞形態(tài)學觀察34-35
• 3.4.2 細胞活性檢測結果35-37
• 3.5 討論37-39
• 4 納米氧化鋅引起Caco-2細胞氧化應激和炎癥反應的研究39-50
• 4.1 前言39
• 4.2 材料39-40
• 4.2.1 細胞株39-40
• 4.2.2 主要試劑40
• 4.2.3 主要儀器40
• 4.3 方法40-41
• 4.3.1 細胞染毒處理40
• 4.3.2 Caco-2 細胞內活性氧（ROS）的測定40
• 4.3.3 炎癥因子表達的測定40-41
• 4.3.4 數(shù)據處理41
• 4.4 結果41-48
• 4.4.1 ROS水平檢測結果41-43
• 4.4.2 炎癥因子IL-8的表達43-45
• 4.4.3 炎癥因子IL-1β的表達45-48
• 4.5 討論48-50
• 5 納米氧化鋅引起Caco-2 細胞死亡的研究50-57
• 5.1 前言50-51
• 5.2 材料51
• 5.2.1 細胞株51
• 5.2.2 主要試劑51
• 5.2.3 主要儀器51
• 5.3 方法51-52
• 5.3.1 細胞染毒處理51
• 5.3.2 AO/EB雙染51
• 5.3.3 細胞死亡方式的測定51-52
• 5.3.4 數(shù)據處理52
• 5.4 結果52-55
• 5.4.1 AO/EB雙染結果52-53
• 5.4.2 細胞死亡方式的測定結果53-55
• 5.5 討論55-57
• 6 結論57-60
• 6.1 研究總結57-59
• 6.2 課題展望59-60
• 參考文獻60-67
• 作者簡歷67

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