本文關鍵詞：基于RNAi研究氟對TGF-β信號通路的影響

  更多相關文章： RNAi 支持細胞 TGF-β1 Smad2 Smad4 Smad6 Smad7 白介素-6 腫瘤壞死因子-α

【摘要】：[目的]本論文通過體外分離培養(yǎng)小鼠睪丸支持細胞,構建siRNA抑制的支持細胞TGF-β1模型,并在此基礎上染氟,檢測相關基因和蛋白的表達情況,探討TGF-β信號通路在氟影響支持細胞免疫豁免功能中的調節(jié)作用機理。[方法]本試驗建立siRNA抑制的支持細胞TGF-β1模型,運用qRT-PCR和Western Blot技術分別檢測轉染后的TGF-β1mRNA和蛋白,在驗證成功的基礎上再進行染氟處理,應用qRT-PCR和ELISA分別檢測TGF-β1、Smad2、Smad4、 Smad6和Smad7mRNA以及支持細胞分泌的免疫相關蛋白白介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達情況。[結果](1)支持細胞培養(yǎng)鑒定結果：通過HE和姬姆薩染色,觀察支持細胞的形態(tài)和生長狀況。進行細胞計數發(fā)現細胞純度達90%,細胞活性良好,可以用于進行模型建立。(2) siRNA最佳轉染濃度的篩選：用不同濃度(20、30、50、100nM)的熒光標記的FAM-siRNA轉染支持細胞,根據綠色熒光強弱篩選siRNA的最佳轉染濃度,確定50nM選為siRNA的最佳轉染濃度。(3) si-TGF-β1有效干擾序列的篩選：三種si-TGF-β1采用50nnM的濃度轉染支持細胞,檢測TGF-β1mRNA和蛋白的表達量,結果表明,siRNAl(si-TGF-β1-1)組和siRNA2 (si-TGF-β1-2)組對小鼠睪丸SCs蛋白TGF-β1的表達較空白對照組明顯降低,其中si-RNA1組的差異極顯著。(4) qRT-PCR結果：各試驗組TGF-β1, Smad2, Smad4, Smad6和Smad7的mRNA表達量和對照組相比沒有統(tǒng)計學意義,但都表現為降低的趨勢。(5) ELISA:結果顯示,IL-6蛋白表達水平在10-4M(mol/L)NaF和10-3M(mol/L)NaF兩組中與對照組相比差異顯著(**P0.01);與對照組相比,各處理組TNF-α的蛋白表達水平呈現降低的趨勢,但差異不顯著。[結論]TGF-β信號通路在氟對睪丸支持細胞免疫豁免功能影響中起到了一定調控作用，可能是通過TGF-β超家族其它成員(TGF-β1除外)、Smad蛋白家族以及免疫相關蛋白IL-6和TNF-α實現的。
【關鍵詞】：RNAi 支持細胞 TGF-β1 Smad2 Smad4 Smad6 Smad7 白介素-6 腫瘤壞死因子-α
【學位授予單位】：山西農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要6-7
• 前言7-9
• 1 文獻綜述9-17
• 1.1 小鼠睪丸支持細胞分離培養(yǎng)及其生物學功能研究進展9-11
• 1.2 轉化生長因子-β(TGF-β)超家族與Smad蛋白家族11-13
• 1.3 RNAi與TGF-β113-17
• 2 試驗材料17-18
• 2.1 試驗動物細胞17
• 2.2 主要試劑與耗材17
• 2.3 主要儀器設備17-18
• 3 試驗方法18-24
• 3.1 試驗模型的建立18-21
• 3.2 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs TGF-β1信號通路相關基因mRNA表達的檢測21-24
• 3.3 應用ELISA檢測氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs免疫相關蛋白表達的影響24
• 3.4 試驗數據統(tǒng)計與分析24
• 4 試驗結果24-30
• 4.1 睪丸SCs分離培養(yǎng)及染色結果24-25
• 4.2 siRNA最佳轉染濃度的篩選結果25-26
• 4.3 TGF-β1有效干擾序列的篩選結果26-28
• 4.4 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs TGF-β1信號通路相關基因mRNA表達的影響28-29
• 4.5 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs免疫相關蛋白表達影響的檢測結果29-30
• 5 分析與討論30-37
• 5.1 試驗模型的建立30-32
• 5.2 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs TGF-β1信號通路相關基因mRNA表達的影響32-34
• 5.3 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs免疫相關蛋白表達的影響34-37
• 全文結論37-38
• 英文縮略詞表38-40
• 參考文獻40-46
• Abstract46-48
• 致謝48

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