本文關(guān)鍵詞：小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能改變?cè)阢U錳聯(lián)合暴露致認(rèn)知功能損傷中的作用及機(jī)制

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【摘要】：近年來(lái),隨著我國(guó)快速工業(yè)化和城市進(jìn)程的發(fā)展,環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。鉛、錳等重金屬污染物造成機(jī)體多系統(tǒng)及器官損傷,尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷的不可逆性逐漸成為人們關(guān)注及研究的熱點(diǎn)。以往對(duì)鉛、錳等重金屬的研究多集中于其單一毒性效應(yīng)而忽視了其聯(lián)合暴露效應(yīng)及機(jī)制的研究。而任何一個(gè)個(gè)體的生存環(huán)境都是一個(gè)復(fù)雜的復(fù)合暴露環(huán)境,研究重金屬污染物對(duì)機(jī)體的損害必需考慮到其聯(lián)合暴露的毒性機(jī)制。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)在腦內(nèi)分布極為廣泛,主要起支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞的作用。近年來(lái)研究還證實(shí)AS在調(diào)節(jié)細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)方面發(fā)揮著重要的作用,尤其是對(duì)興奮性氨基酸—谷氨酸(glutamic acid,Glu)的調(diào)節(jié)。而谷氨酸在細(xì)胞外的蓄積被認(rèn)為是產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性的主要原因。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的免疫駐留細(xì)胞,許多研究發(fā)現(xiàn)在生理及病理狀態(tài)下,MG都可以對(duì)AS發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)低劑量鉛(lead,Pb)能引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷,同時(shí)鉛暴露可以誘導(dǎo)不同發(fā)育階段仔鼠大腦海馬中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體谷氨酸-胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glatamate aspartate transporter,GLAST)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamate transporter-1,GLT-1)等蛋白表達(dá)的降低,而這些轉(zhuǎn)運(yùn)體或蛋白都是星形膠質(zhì)細(xì)胞重?cái)z取細(xì)胞外谷氨酸并合成谷氨酰胺的關(guān)鍵性蛋白。有研究顯示錳(manganese,Mn)攝入過(guò)量可以對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷,能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞GS的活性以及GLAST和GLT-1的表達(dá)。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鉛、錳在單獨(dú)暴露下能夠誘導(dǎo)MG活化,結(jié)合鉛、錳暴露對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及其谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的影響,我們推測(cè)在鉛、錳聯(lián)合暴露中小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能會(huì)調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞功能進(jìn)而影響神經(jīng)元功能,從而最終誘導(dǎo)認(rèn)知功能的損傷。研究目的:本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠、BV2細(xì)胞、C6細(xì)胞、原代小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象,探討低劑量鉛錳聯(lián)合暴露對(duì)不同類型膠質(zhì)細(xì)胞活化順序的影響以及對(duì)神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞間谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的影響,闡明小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能改變?cè)阢U錳聯(lián)合暴露致認(rèn)知功能損傷中的作用及機(jī)制,為低劑量鉛錳聯(lián)合暴露致學(xué)習(xí)記憶功能損傷提供新的理論依據(jù)。研究方法:1.飲水染毒建立鉛錳聯(lián)合暴露動(dòng)物模型;建系細(xì)胞和原代細(xì)胞建立體外共培養(yǎng)模型。2.原子吸收分光光度法檢測(cè)SD大鼠血鉛和血錳含量;膜片鉗技術(shù)檢測(cè)LTP;通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠逃避潛伏期時(shí)間和目的象限停留時(shí)間百分比評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。MTT篩選建系細(xì)胞體外染毒劑量;免疫熒光法和Western blot篩選原代細(xì)胞體外染毒劑量。3.免疫熒光法和Western blot檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的活化和谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關(guān)蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:1.鉛錳聯(lián)合暴露動(dòng)物模型的建立在100ppm Pb、2.5g/L Mn、5g/L Mn、Pb+2.5g/L Mn和Pb+5g/L Mn的暴露劑量下,通過(guò)原子吸收法檢測(cè)血鉛和血錳含量、膜片鉗技術(shù)檢測(cè)LTP的誘導(dǎo)水平和水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出鉛的染毒劑量為100ppm,錳的劑量為2.5g/L。2.鉛錳聯(lián)合暴露對(duì)認(rèn)知功能損傷的協(xié)同效應(yīng)1)染毒3w后,各暴露組LTP誘導(dǎo)水平與對(duì)照組相比均顯著降低(p0.05),并在聯(lián)合暴露組出現(xiàn)協(xié)同損傷效應(yīng)。2)水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示,各暴露組大鼠逃避潛伏期時(shí)間和目的象限停留時(shí)間百分比與對(duì)照組相比差異顯著,聯(lián)合暴露時(shí)差異更為顯著(p0.05)。3.鉛錳聯(lián)合暴露對(duì)不同類型膠質(zhì)細(xì)胞活化的時(shí)間效應(yīng)及活化后的影響1)免疫熒光法和Western blot法檢測(cè)SD大鼠海馬部位小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及各自特異性活化maker的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,暴露3d后,與對(duì)照組相比,鉛錳聯(lián)合暴露組小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)顯著活化,OX-42表達(dá)水平明顯升高(p0.05);而星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變。5d后,各暴露組小膠質(zhì)細(xì)胞均呈現(xiàn)活化狀態(tài)并在聯(lián)合暴露時(shí)更顯著,此時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞在聯(lián)合暴露組也出現(xiàn)了顯著活化,GFAP表達(dá)水平顯著升高(p0.05)。Western blot法檢測(cè)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,暴露2w后,GS、GLT-1和GLAST的表達(dá)水平明顯降低,且在聯(lián)合暴露時(shí)降低更為顯著(p0.05)。2)篩選合適的鉛錳聯(lián)合暴露體外染毒劑量10μmol/L醋酸鉛和100μmol/L氯化錳,時(shí)間為24h。建系細(xì)胞與原代細(xì)胞在直接刺激時(shí)GFAP、GS、GLT-1和GLAST蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均沒(méi)有明顯改變。共培養(yǎng)后,鉛錳聯(lián)合暴露可以引起GS、GLT-1和GLAST表達(dá)降低(p0.05)。4.米諾環(huán)素干預(yù)對(duì)鉛錳聯(lián)合暴露毒性損傷的拮抗作用1)用米諾環(huán)素(Minocycline)拮抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化后,與各暴露組相比,米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷得到一定程度的緩解(p0.05)。2)免疫熒光法檢測(cè)暴露2w后海馬部位膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),發(fā)現(xiàn)各暴露組小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)顯著活化,聯(lián)合暴露活化更為明顯;在米諾環(huán)素干預(yù)下各暴露組小膠質(zhì)細(xì)胞活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化均得到顯著抑制(p0.05)。Western blot結(jié)果顯示,各暴露組GS、GLT-1和GLAST表達(dá)水平出現(xiàn)降低,在聯(lián)合暴露時(shí)出現(xiàn)協(xié)同降低,米諾環(huán)素干預(yù)后各暴露組谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的降低得到顯著回升(p0.05)。研究結(jié)論:1.低劑量鉛錳聯(lián)合暴露可以產(chǎn)生協(xié)同神經(jīng)毒性,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能受損;2.膠質(zhì)細(xì)胞活化參與了鉛錳聯(lián)合暴露所誘導(dǎo)神經(jīng)毒性進(jìn)程。在鉛錳聯(lián)合暴露條件下,小膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活,繼而星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)活化進(jìn)而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)遭到破壞,使神經(jīng)元功能受到損傷,證實(shí)了星形膠質(zhì)細(xì)胞在學(xué)習(xí)記憶功能中的重要作用;3.以米諾環(huán)素拮抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化后,星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及其谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的損傷得到顯著緩解,學(xué)習(xí)記憶功能的損傷也得到顯著恢復(fù),揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞活化在星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能改變中發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：鉛 錳 小膠質(zhì)細(xì)胞 星形膠質(zhì)細(xì)胞 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán) 學(xué)習(xí)記憶
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)回顧15-26
• 實(shí)驗(yàn)一 鉛錳聯(lián)合暴露動(dòng)物模型的建立26-33
• 1 材料26-27
• 2 方法27-29
• 3 結(jié)果29-31
• 4 討論31-33
• 實(shí)驗(yàn)二 鉛錳聯(lián)合暴露對(duì)認(rèn)知功能損傷的協(xié)同效應(yīng)33-38
• 1 材料33-34
• 2 方法34-35
• 3 結(jié)果35-37
• 4 討論37-38
• 實(shí)驗(yàn)三 鉛錳聯(lián)合暴露對(duì)不同類型膠質(zhì)細(xì)胞活化的時(shí)間效應(yīng)及活化后的影響38-61
• 1 材料38-41
• 2 方法41-46
• 3 結(jié)果46-58
• 4 討論58-61
• 實(shí)驗(yàn)四 米諾環(huán)素干預(yù)對(duì)鉛錳聯(lián)合暴露毒性損傷的拮抗作用61-69
• 1 材料61-63
• 2 方法63-64
• 3 結(jié)果64-67
• 4 討論67-69
• 小結(jié)69-70
• 參考文獻(xiàn)70-82
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果82-83
• 致謝83

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本文編號(hào)：541486