本文關鍵詞：TCE致L-02肝細胞毒性中SET相關的表現(xiàn)遺傳調(diào)控機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：三氯乙烯(Trich Loroethy Lene,TCE)是一種工業(yè)上廣泛使用的有機溶劑,同時也是一種重要的環(huán)境污染物。其可通過多種途徑進入人體,肝臟作為其主要的代謝場所,三氯乙烯代謝物蓄積于肝臟,導致肝毒性發(fā)生或引發(fā)肝損傷,嚴重者甚至發(fā)生肝衰竭或死亡。對TCE致肝細胞毒性的作用機制了解尚淺。SET基因在肝細胞和乳腺癌細胞中高表達,其自身作為一種原癌基因,參與了生物體內(nèi)多種重要的生理過程:例如細胞凋亡,轉錄過程,染色體復制等。課題組前期研究篩選出SET差異表達蛋白,初步研究了SET相關的表觀遺傳調(diào)控因子對TCE致肝細胞毒性效應的影響,檢測了TCE作用下肝細胞中基因組整體甲基化變化情況。但SET相關的表觀遺傳調(diào)控機制是如何解釋TCE誘導肝細胞毒性效應這一問題尚待研究,本論文將進一步研究SET基因啟動子甲基化變化對TCE致肝細胞毒性效應的作用機制,及初步探索SET相關的mi RNA調(diào)控能否解釋TCE致肝細胞毒性效應的發(fā)生機理。方法和結果 本課題從以下兩方面開展研究:研究1:TCE作用下肝細胞中SET基因啟動子區(qū)甲基化檢測分析方法:培養(yǎng)L-02肝細胞,使用不同濃度的TCE(0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L)處理L-02細胞24 h,提取細胞基因組DNA,用亞硫酸氫鹽試劑盒進行修飾,設計引物后進行PCR擴增,分子克隆和測序。結果及結論:與對照組相比,TCE處理的L-02肝細胞中SET基因啟動子區(qū)甲基化水平下降,且隨著TCE染毒濃度的增加,SET基因啟動子區(qū)甲基化水平遞減。對甲基化差異位點進行分析發(fā)現(xiàn),p0.05的差異甲基化位點有73個,這些位點中已知序列名稱的有24個;位于轉錄因子結合區(qū)的差異甲基化位點有9個,這些位點上均有多個已知的轉錄因子結合。差異甲基化位點的出現(xiàn)限制了轉錄因子的結合,造成染色體結構穩(wěn)定性改變,導致SET基因表達異常,驗證了SET蛋白是TCE作用下肝細胞中的表達升高的差異蛋白(結合課題組前期研究基礎)。研究2:TCE作用下肝細胞中SET相關的mi RNA調(diào)控的初步研究方法:通過mi RNA靶基因預測軟件和文獻查找方法初步篩選出SET相關的多個mi RNAs,然后使用RT-PCR檢測這些mi RNAs的表達情況,以表達下調(diào)的mi RNAs作為研究對象。構建這些mi RNAs的病毒載體,獲取相應病毒上清后轉染L-02肝細胞,構建穩(wěn)定高表達mi RNAs肝細胞并對其高表達效率進行鑒定。結果及結論:利用多種預測軟件和文獻查找初篩了9個候選mi RNAs,即mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a,mi RNA-29b,mi RNA-199a,mi RNA-194,mi RNA-221和mi RNA-129。但表達下調(diào)的mi RNAs為mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a。成功構建了其中三個mi RNAs重組病毒載體,轉染L-02肝細胞后,這些mi RNAs在轉染細胞中的RT-PCR分析顯示,與轉染空病毒載體的對照組相比,mi R-199b/21/23a等的相對表達量是對照組的1300、3、5倍以上,說明穩(wěn)定高表達mi R-199b/21/23a肝細胞構建成功。
【關鍵詞】：L-02肝細胞 SET蛋白 DNA甲基化 miRNA調(diào)控
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 三氯乙烯簡介12-13
• 1.1.1 三氯乙烯的生物毒性12-13
• 1.2 SET蛋白綜述13-14
• 1.3 表觀遺傳調(diào)控14-18
• 1.3.1 DNA甲基化15-16
• 1.3.2 mi RNA調(diào)控16-18
• 1.4 課題研究基礎、目的意義及實驗方案18-20
• 1.4.1 課題研究基礎18
• 1.4.2 課題研究的目的意義18-19
• 1.4.3 課題研究方案19-20
• 1.5 課題研究的創(chuàng)新點20-21
• 第2章 材料與方法21-51
• 2.1 實驗材料21-24
• 2.1.1 主要儀器設備21-22
• 2.1.2 主要試劑22-23
• 2.1.3 細胞及細胞受試物23-24
• 2.2 實驗方法24-51
• 2.2.1 培養(yǎng)基和常用試劑的配制24-25
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)和染毒25
• 2.2.3 細胞DNA提取25-26
• 2.2.4 DNA的亞硫酸氫鹽修飾26-30
• 2.2.5 PCR擴增30-32
• 2.2.6 基因克隆和測序32-34
• 2.2.7 統(tǒng)計檢驗分析34
• 2.2.8 獲得與SET基因關聯(lián)的目的mi RNA34-37
• 2.2.9 獲得mi RNA初級轉錄本Pri-mi RNA基因產(chǎn)物37-42
• 2.2.10 p CI Mamma Lian Expression Vector質(zhì)粒載體的雙酶切及回收42-43
• 2.2.11 p CI Mamma Lian Expression Vector質(zhì)粒載體與Pri-mi RNA基因產(chǎn)物的連接43
• 2.2.12 連接產(chǎn)物的轉化43
• 2.2.13 Pri-mi RNA重組質(zhì)粒載體的鑒定、擴增及提取43-45
• 2.2.14 獲得含綠色熒光基因的Pri-mi RNA基因序列45-47
• 2.2.15 雙酶切p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒載體47-48
• 2.2.16 雙酶切后的p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒載體與Zsgreen+Pri-mi R-21/23A/20A/199B產(chǎn)物的連接48
• 2.2.17 連接產(chǎn)物的轉化48-49
• 2.2.18 Pri-mi RNA重組病毒載體的鑒定、擴增及提取49
• 2.2.19 轉染Pri-mi RNA重組病毒載體進行病毒包裝49
• 2.2.20 病毒滴度檢測與濃縮49-50
• 2.2.21 病毒上清轉染L-02肝細胞50
• 2.2.22 mi RNA重組病毒載體在肝細胞中的表達鑒定50-51
• 第3章 結果與分析51-80
• 3.1 TCE作用下肝細胞中SET基因啟動子區(qū)甲基化檢測分析51-70
• 3.1.1 DNA完整性檢測51
• 3.1.2 SET基因五段啟動片段的甲基化位點測序結果51-66
• 3.1.3 SET基因啟動子區(qū)甲基化水平分析66
• 3.1.4 SET基因啟動子區(qū)甲基化位點分析66-69
• 3.1.5 SET基因啟動子區(qū)差異甲基化及其結合轉錄因子分析69-70
• 3.2 TCE作用下肝細胞中SET相關的mi RNA調(diào)控的初步研究70-80
• 3.2.1 候選mi RNAs的相對定量檢測分析70-74
• 3.2.2 Pri-mi RNA質(zhì)粒載體的鑒定74-76
• 3.2.3 Pri-mi RNA重組病毒載體的鑒定76-78
• 3.2.4 Pri-mi RNA重組病毒載體的病毒上清轉染L-02肝細胞及其表達鑒定78-80
• 第4章 討論與結論80-86
• 4.1 TCE作用下肝細胞中SET基因啟動子區(qū)甲基化水平檢測分析80-82
• 4.1.1 SET基因啟動子區(qū)甲基化水平檢測分析80-82
• 4.2 TCE作用下肝細胞中SET相關的mi RNAs調(diào)控的初步研究82-86
• 4.2.1 生物信息學篩選mi RNAs82-83
• 4.2.2 SET相關的mi RNA調(diào)控及mi RNA治療展望83-86
• 4.3 結論86
• 課題展望86-87
• 參考文獻87-96
• 附錄：英文縮略詞表96-97
• 綜述97-109
• 參考文獻103-109
• 致謝109-110
• 攻讀碩士學位期間取得的成果110-112

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 彭巨成;劉益民;余日安;吳禮康;吳泰順;朱志良;;三氯乙烯對大鼠肝細胞凋亡及c-myc和p53基因表達的影響[J];毒理學雜志;2010年04期

2 劉建軍;黃海燕;趙錦;莊志雄;袁建輝;陽帆;何建凡;李習藝;;三氯乙烯誘導人L-02肝細胞適應性反應的差異蛋白質(zhì)組學分析[J];中國藥理學與毒理學雜志;2006年04期

3 彭巨成;劉益民;余日安;吳禮康;吳泰順;朱志良;;三氯乙烯對大鼠肝細胞DNA損傷和氧化應激的影響[J];職業(yè)與健康;2009年24期

  本文關鍵詞：TCE致L-02肝細胞毒性中SET相關的表現(xiàn)遺傳調(diào)控機制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：467532