適配體是功能性的單鏈非編碼DNA、RNA及其衍生物,可通過形成包括莖環(huán)、發(fā)夾和G-四鏈體在內的多種二級結構,以高親和力和特異性識別、結合靶標,具有穩(wěn)定性好、成本低、保質期長和易于修飾等獨特優(yōu)勢。本研究擬在國內外有關寡核苷酸適配體的研究基礎上,以本課題組篩選得到的單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌的適配體為原始序列,通過剪裁、修飾等手段對序列進行優(yōu)化,以期得到親和力、特異性和穩(wěn)定性得到改良的適配體序列。并探討適配體構象與其親和力的內在關系,對其與靶標的結合機制進行深入探究。在此基礎上利用適配體特異性識別模式,結合三價DNA過氧化物模擬酶(DNAzyme)構建一種方便、新穎、靈敏度高的副溶血性弧菌可視化檢測方法。主要工作內容如下:首先,以本課題組篩選得到的單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌原始適配體序列為基礎,以親和力、特異性和穩(wěn)定性為評價指標,借助剪裁、鎖核酸(LNA)取代和定點突變等優(yōu)化手段,獲得了兩條優(yōu)化后的適配體。其中單增李斯特氏菌優(yōu)化適配體A15-8僅含24個堿基,通過流式細胞術分析得出其與單增李斯特氏菌的解離常數(shù)(K_d)值為32.84±1.33nmol...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略符號說明
1 緒論
    1.1 食源性致病菌及其傳統(tǒng)檢測技術
        1.1.1 微生物檢測方法
        1.1.2 分子生物學方法
        1.1.3 免疫學方法
    1.2 適配體
        1.2.1 適配體概述
        1.2.2 適配體優(yōu)化方法
            1.2.2.1 截短
            1.2.2.2 化學修飾
            1.2.2.3 二價或多價適配體
            1.2.2.4 隨機或定點突變
        1.2.3 光學適配體傳感器在食源性致病菌檢測中的應用
            1.2.3.1 化學發(fā)光法
            1.2.3.2 熒光法
            1.2.3.3 表面增強拉曼光譜法
            1.2.3.4 表面等離子體共振法
            1.2.3.5 比色法
    1.3 DNA過氧化物模擬酶
        1.3.1 DNA過氧化物模擬酶概述
        1.3.2 DNAzyme在致病菌檢測方面的應用和研究進展
    1.4 本課題的立題意義與研究內容
2 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料和設備
        2.1.1 實驗菌種
        2.1.2 實驗試劑
    2.2 主要儀器
    2.3 適配體序列的表征
        2.3.1 適配體親和力分析
        2.3.2 適配體特異性分析
        2.3.3 適配體穩(wěn)定性分析
    2.4 適配體功能化MNP捕獲效率的考察
        2.4.1 氨基化磁珠的制備與表征
        2.4.2 氨基化磁珠的適配體功能化
        2.4.3 適配體功能化MNP捕獲效率的計算
        2.4.4 實際樣品捕獲效率的考察
    2.5 細菌表面結合位點的鑒定
        2.5.1 細菌表面結合位點的初步確定
        2.5.2 利用適配體功能化MNP確定細菌表面結合位點
            2.5.2.1 細菌破碎液中靶標的捕獲
            2.5.2.2 膜蛋白提取液中靶標的捕獲
    2.6 副溶血性弧菌可視化檢測方法的構建
        2.6.1 檢測原理
        2.6.2 適配體傳感器的制備
        2.6.3 副溶血性弧菌的檢測
        2.6.4 可行性分析
        2.6.5 實驗條件的優(yōu)化
            2.6.5.1 適配體功能化MNP與 ssDNA連接條件優(yōu)化
            2.6.5.2 適配體傳感器與靶標孵育條件優(yōu)化
            2.6.5.3 催化反應條件優(yōu)化
        2.6.6 特異性實驗
        2.6.7 副溶血性弧菌的實際樣品檢測
3 結果與討論
    3.1 單核細胞增生李斯特氏菌適配體的優(yōu)化、機理研究及簡單應用
        3.1.1 單增李斯特氏菌適配體的優(yōu)化
        3.1.2 單增李斯特氏菌適配體功能化MNP捕獲效率的考察
            3.1.2.1 氨基化磁珠的表征
            3.1.2.2 親和素包被的氨基化磁珠的表征
            3.1.2.3 磁珠與生物素化適配體連接條件的優(yōu)化
            3.1.2.4 適配體功能化MNP與細菌孵育條件優(yōu)化
            3.1.2.5 適配體功能化MNP富集特異性的考察
            3.1.2.6 適配體功能化MNP的靶標捕獲性能
            3.1.2.7 單核細胞增生李斯特氏菌的實際樣品富集應用
        3.1.3 單增李斯特氏菌適配體細菌表面結合位點的鑒定
    3.2 副溶血性弧菌適配體的優(yōu)化、機理研究及簡單應用
        3.2.1 副溶血性弧菌適配體的優(yōu)化
        3.2.2 副溶血性弧菌適配體功能化MNP捕獲效率的考察
            3.2.2.1 適配體功能化MNP富集特異性的考察
            3.2.2.2 適配體功能化MNP的靶標捕獲性能
            3.2.2.3 副溶血性弧菌的實際樣品富集應用
        3.2.3 副溶血性弧菌表面結合位點的鑒定
            3.2.3.1 細菌表面結合位點的初步確定
            3.2.3.2 分子下拉確定細菌表面結合位點
    3.3 副溶血性弧菌可視化檢測方法的構建
        3.3.1 可行性分析
        3.3.2 實驗條件優(yōu)化
            3.3.2.1 適配體功能化MNP與 ssDNA連接條件優(yōu)化
            3.3.2.2 適配體傳感器與靶標孵育條件優(yōu)化
            3.3.2.3 催化反應條件優(yōu)化
        3.3.3 適配體傳感器的特異性
        3.3.4 副溶血性弧菌檢測的線性范圍和檢測限
        3.3.5 副溶血性弧菌的實際樣品檢驗
主要結論與展望
    主要結論
    展望
致謝
參考文獻
附錄：作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3770238