丙烯酰胺誘導HT22小鼠海馬神經(jīng)元損傷作用的研究

發(fā)布時間：2017-04-17 05:18

本文關(guān)鍵詞：丙烯酰胺誘導HT22小鼠海馬神經(jīng)元損傷作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一種高水溶性的α,β-不飽和羰基化合物,主要用來合成聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺在采礦業(yè)、污水凈化、造紙業(yè)等領(lǐng)域應用廣泛。聚丙烯酰胺無毒,但丙烯酰胺單體是有毒的。自2002年科學家們發(fā)現(xiàn)富含淀粉的食物在經(jīng)受高溫油炸或烘烤時能生成丙烯酰胺后,其危害日益引起人們的重視。動物實驗證實,丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、致癌性、遺傳毒性、生殖毒性,但在人群中卻只發(fā)現(xiàn)了它的神經(jīng)毒性。丙烯酰胺神經(jīng)毒性的臨床表現(xiàn)為共濟失調(diào)、骨骼肌無力,體重減輕;病理表現(xiàn)為中樞和周圍神經(jīng)軸突的遠端腫脹和終末變性,并逐漸向近端擴展。丙烯酰胺引起神經(jīng)毒性的可能機制主要有抑制快速軸突運輸、改變神經(jīng)遞質(zhì)水平和功能、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、影響細胞骨架系統(tǒng)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝等。此外,氧化應激和促進細胞凋亡也可能是丙烯酰胺潛在的神經(jīng)毒性機制。我們實驗室前期工作已證實:丙烯酰胺亞急性染毒能夠引起幼年大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷,大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元和小腦皮質(zhì)內(nèi)浦肯野細胞發(fā)生變性損傷;胚胎期和哺乳期暴露于丙烯酰胺能導致幼鼠出生時體重降低,哺乳期間體重增長緩慢,并影響到海馬神經(jīng)元的發(fā)育。海馬主要參與學習、記憶、情緒反應等多種功能活動,其損傷能對學習記憶產(chǎn)生影響,有研究證實丙烯酰胺能夠損傷海馬,但損傷的具體機制目前尚不明確。為此,我們開展了丙烯酰胺的體外毒性研究。HT22細胞是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細胞,具有典型的神經(jīng)元形態(tài)及特征,其表型與神經(jīng)元前體細胞最為相似,被廣泛應用于研究藥物的神經(jīng)毒性、神經(jīng)元的損傷和保護之中。但用HT22細胞來建立丙烯酰胺體外損傷模型的相關(guān)研究少見報道,故本研究以HT22細胞為細胞模型,研究丙烯酰胺對海馬神經(jīng)元的損傷作用,并對其損傷的可能機制進行探討。方法:1.丙烯酰胺對HT22細胞存活率的影響及模型濃度的篩選:當HT22細胞生長至對數(shù)期時,加入不同濃度的丙烯酰胺,處理24h、36h和48h,MTT法檢測細胞的增殖狀態(tài),并選擇合適的濃度進行后續(xù)的實驗。2.丙烯酰胺對HT22細胞損傷的影響研究:當HT22細胞生長至對數(shù)期時,加入不同濃度的丙烯酰胺處理24h后,倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)變化;Hoechst33258染色來觀察各組細胞核的變化;應用試劑盒檢測乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量。3.丙烯酰胺對HT22細胞氧化應激的影響研究:用DCFH-DA熒光探針來檢測活性氧ROS的含量;黃嘌呤氧化法檢測超氧化物歧化酶(SOD)的活力;硫代巴比妥酸(TBA)法檢測丙二醛(MDA)的含量;二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法檢測還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。4.丙烯酰胺對HT22細胞凋亡的影響研究:羅丹明123(Rh123)染色檢測線粒體膜電位(MMP)的變化;Western blot法檢測Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3蛋白的表達。結(jié)果:1.不同濃度的丙烯酰胺(0、1、2、3、4、8、16mmol/L)處理HT22細胞24h、36h和48h后,細胞存活率隨著濃度的增加和時間的延長而降低,說明丙烯酰胺對HT22細胞存活率的影響呈時間和劑量依賴性。2.我們選用0、1、2、3mmol/L的丙烯酰胺濃度處理HT22細胞24h來作為后續(xù)實驗的損傷濃度。倒置顯微鏡下觀察到隨著濃度的升高,細胞胞體逐漸變圓,突起變短,折光率下降;用Hoechst33258染料染色,對照組細胞核均勻淡染,邊緣清晰;而染毒組的細胞核有深染固縮、形狀不規(guī)則、裂解的核出現(xiàn),與對照組相比異常核的數(shù)量也有增加;且隨著ACR濃度的增加,培養(yǎng)上清中LDH的含量也顯著增加(P0.05 vs對照組)。3.丙烯酰胺處理HT22細胞24h后,細胞內(nèi)ROS的積聚增加,MDA的含量升高,SOD的活性下降,GSH的含量下降。4.丙烯酰胺處理HT22細胞24h后,細胞線粒體膜電位下降;Bax和Cleaved caspase3蛋白的表達水平上調(diào),Bcl-2蛋白的表達水平下調(diào)。結(jié)論:1.丙烯酰胺可以抑制HT22細胞的增殖,且對其影響呈時間和劑量依賴性。2.丙烯酰胺染毒能導致HT22細胞形態(tài)改變、細胞核凋亡、細胞膜損傷。3.丙烯酰胺的神經(jīng)毒性機制,可能是通過增加細胞內(nèi)ROS的積聚和MDA的含量,降低SOD的活性和GSH的含量,產(chǎn)生氧化應激損傷來實現(xiàn)的。4.丙烯酰胺的神經(jīng)毒性機制,還可能與降低線粒體膜電位,上調(diào)Bax和Cleaved caspase3蛋白的表達,下調(diào)Bcl-2蛋白的表達,進而誘發(fā)HT22細胞的凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：丙烯酰胺 HT22 氧化應激 凋亡
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：